IPSCs-derived NESCs for Neuroregeneration in Machado-Joseph disease.

Abstract

A ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante. A MJD tem como causa uma mutação no gene MJD1/ATXN3, no qual uma expansão do trinucleótido CAG resulta na presença de um tracto de poliglutamina expandido na proteina ataxina-3. O gene ATXN3 mutado apresenta 55-87 repetiçoes do trinucleótido CAG, enquanto que o gene normal apresenta apenas 10-51 repetiçoes. A MJD é caracterizada por uma extensa morte neuronal, afectando principalmente o cerebelo, assim como os sistemas piramidal, extrapiramidal, oculomotor e neurónios motores. Os sintomas mais commummente apresentados pelos pacientes incluem coordenação motora comprometida, disartria e disfagia, não existindo atualmente terapias capazes de parar ou atrasar a progressão da doença. Estratégias de terapia celular apresentam grande potencial na substituição de neurónios comprometidos ou mortos. Células estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs) são obtidas através da reprogramação de células somáticas em células pluripotentes. Estas iPSCs são subsequentemente induzidas em células da neuroectoderme, nomeadamente células estaminais neuroepiteliais (NESCs) que após diferenciação dão origem a células do sistema nervoso. NESCs já foram utilizadas em estratégias de terapia celular, visando a substituição celular, em modelos de murganho de doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson. No presente trabalho temos como objetivo avaliar o potencial de células estaminais neuroepiteliais derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas humanas, para serem usadas em estratégias de substituição celular e neuroprotectoras em doenças neurodegenerativas como a MJD. Deste modo, quatro linhas celulares foram estabelecidas (uma linha celular de NESCs controlo e três linhas de NESCs obtidas de pacientes com MJD) e foram minuciosamente caracterizadas. A sua multipotencia foi analisada, nomeadamente a capacidade de dar origem a neurónios funcionais assim como células da glia após diferenciação. Foi também avaliado se estas linhas celulares apresentavam diferenças a nível de funcionalidade neuronal, nomeadamente o tamanho das neurites bem como o número de sinapses. Os nossos resultados indicam que as células estaminais neuroepiteliais derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas humanas são capazes de se diferenciarem em neurónios funcionais e células da glia não tendo sido observadas disfunções neuronais nas linhas celulares obtidas de pacientes com MJD. Adicionalmente, NESCs foram transplantadas no cerebelo de murganhos NOD.scid. Dois meses após o transplante, observamos que as NESCs transplantadas sobreviveram e foram capazes de se diferenciarem em neurónios e células da glia, sem a presença de grandes sinais de rejeição do transplante. Assim, os resultados do presente trabalho revelam que células estaminais neuroepiteliais derivadas de células estaminais pluripotentes induzidas humanas têm grande potencial para serem usadas em estratégias de terapia celular no tratamento da doença de Machado-Joseph.

Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph disease (MJD), is an autosomal dominant neurodegenerative disease. MJD arises from a mutation in the MJD1/ ATXN3 gene, in which an increased number of the trinucleotide CAG results in an expanded polyglutamine tract in the Ataxin-3 protein. The mutated ATXN3 gene has 55-87 CAG repeats, while the normal gene has 10-51 repeats. MJD is characterized by extensive neuronal death, affecting mainly the cerebellar system, as well as the pyramidal, extrapyramidal, motor neuron and oculomotor systems. The most common symptoms presented by patients are impaired motor coordination, dysarthria and dysphagia, and presently there is no therapy available to stop or delay the progression of this disease. Cell therapies hold the promise to replace impaired and death neurons. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are obtained by reprogramming somatic cells into pluripotent cells. The iPSCs are then induced into cells of the neuroectoderm, namely neuroepithelial stem cells (NESCs) that upon differentiation give rise to cells of the nervous system. NESCs have been successfully used for cell replacement strategies in mouse models of neurodegenerative diseases as Parkinson´s disease. In the present study we aimed to assess the potential of human iPSCs-derived NESCs to be used as a cell-replacement and neuroprotective strategy in neurodegenerative diseases as MJD. Thus, four cell lines established in the lab (one cell line of NESCs obtained from a control and three cell lines of NESCs obtained from MJD patients) were thoroughly characterized. The multipotency of the obtained cells was assessed, namely the ability to give rise to glia cells and functional neurons upon differentiation. It was evaluated whether the cell lines of MJD patients have differences on the neuronal functionality, namely neurites length and number of functional synapses. Our results indicate that upon differentiation human iPSCs-derived NESCs give rise to glial cells and functional neurons, and no impairments in neuronal functionality were observed for the cell lines of MJD patients. Additionally, NESCs were transplanted into the cerebellum of adult NOD.scid mice. It was observed that two months upon transplantation the NESCs survived and were able to differentiate into neurons and glial cells, without major signs of immune rejection. Thus, results reveal that iPSCs-derived NESCs have potential to be used in cell replacement and neuroprotective strategies in MJD.