High Fructose Feeding and Hepatic Fatty Liver Disease Inflammation: The Role of Intestinal Microbiota

Abstract

Chronic metabolic diseases related to obesity and lifestyle are imposing an ever-increasing burden on healthcare worldwide. Incidences of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and Type-2 diabetes (T2D) have been rising particularly rapidly in Western Societies, showing strong associations with sedentary lifestyle and excessive caloric intake in relation to daily expenditure. A significant fraction of this hypercaloric intake is accounted by sugar, in particular fructose, present in processed food and sweetened beverages. This diet promotes weight gain, insulin resistance and dyslipidemia thereby providing the foundations for NAFLD and T2D development. In addition to directly disrupting the control of systemic carbohydrate and lipid metabolism, such diets may also mediate these effects indirectly via the gut microbiome. The gut microbiome is a complex ecosystem that is normally in a symbiotic relationship with the host and having a key role in nutrient processing and energy harvest. In obesity-related diseases such as NAFLD and T2D, dysbiotic alterations in the microbiome composition, its metabolic endproducts, and its interactions with host tissues, are implicated in their pathogenesis. The first part of this work aimed to study the effects of a diet high in simple sugars on the composition of the intestinal microbiome and its metabolite products in mouse models. It was hypothesized that dietary glucose and fructose have distinct effects on these parameters with focus on the relative abundance of Gram-negative species and alterations in SCFA levels. Three groups of mice were fed over 10 weeks with standard, high glucose or high fructose chow. Fecal samples were periodically collected and the microbiome was profiled by real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Fecal metabolites were analyzed by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). On the metabolites content significant differences were also observed with a reduction in beneficial SCFA like butyrate, to be induced by fructose. For the mice fed the high fructose diet, unmetabolized fructose was found in the feces indicating that the intestinal absorption capacity had been saturated and that fructose was available to the entire intestinal microbiome. Mice fed the high fructose diets also showed a shift in microbiome species towards Gram-negative bacteria and decreased fecal levels of butyrate relative to acetate and propionate. An increased abundance of Gram-negative bacteria could promote visceral inflammation through increased abundance and leakage of endotoxin from the intestinal lumen into surrounding tissues. In addition, alterations in microbiome metabolic endproducts such as lactate and short-chain fatty acids (SCFA) can have an impact on intestinal as well as hepatic and peripheral metabolism through direct substrate effects as well as by activation of substrate-specific receptors such as the GPR family. In the second part of the Thesis, the specific contributions of dietary glucose and fructose to hepatic and adipose tissue lipogenesis were determined by integrating 2H-enrichment of triglyceride from deuterated water to provide estimates of de novo lipogenesis (DNL) and glycerol synthesis from all sources with 13C-triglyceride (TG) enrichment from 13C-glucose and fructose tracers to provide specific contributions of each exogenous sugar. In liver, exogenous fructose contributed significantly more to both DNL and glycerol synthesis compared to exogenous glucose. Moreover, fructose promoted the synthesis of saturated fatty acids to a greater degree than that of oleate whereas glucose did not. Fructose also contributed to mesenteric adipose tissue TG synthesis, albeit to a lesser degree than glucose while only glucose contributed to subcutaneous adipose tissue TG synthesis. In conclusion, this dissertation provided new insights on the role of the intestine and visceral adipose tissue in the metabolism of dietary glucose and fructose and has opened two important new lines of research. First, the potential for overflow of fructose into the lower intestine: to what extent does this happen in humans in the Western diet setting and how does this influence microbiome composition and metabolism? In this context, there is evidence that fructose malabsorption in the human population may be more widespread than initially thought. Second, the lipogenic utilization of fructose carbons by mesenteric adipose tissue begs the question of how this sugar became available to these adipocytes. Was it via direct absorption or was it converted beforehand to glucose by intestinal gluconeogenesis? If it was by direct absorption, this implies that mesenteric adipocytes have a capacity for fructose uptake and metabolism. Also, it suggests that mesenteric adipose tissue has some degree of privileged access to nutrients that are absorbed by the intestine.

As doenças metabólicas crónicas associadas a obesidade e estilo de vida representam um encargo significativamente crescente na saúde mundial. Nas sociedades ocidentais, as incidências de fígado gordo não alcoólico (NAFLD) e diabetes tipo 2 (T2D) têm aumentado consideravelmente correlacionando-se com sedentarismo e consumo excessivo de calorias perante o consumo diário. Nestas dietas hipercalóricas, o açúcar é maioritário em especial a frutose, presente em concentrações elevadas nos alimentos processados. Estas condições estimulam o aumento de peso, resistência à insulina e dislipidémia, que estão na base do desenvolvimento de NAFLD e T2D. Para além destas dietas promoverem distúrbios diretos no metabolismo de lípidos e hidratos de carbono, podem derivar indiretamente os mesmos efeitos, através do microbioma intestinal. Este é um ecossistema complexo que normalmente se encontra em simbiose com o hospedeiro, o que é fundamental para o processamento de nutrientes e extração de energia. Alterações às populações microbianas e perda de simbiose, produtos metabólicos dessas espécies e a respetiva interação com vários tecidos do hospedeiro estão na origem das patologias referidas. A primeira parte deste trabalho visou estudar, em modelos de ratinho, o efeito de dietas ricas em açúcares simples, na composição do microbioma intestinal e dos seus produtos metabólicos. A hipótese propunha que a glicose e frutose produzem efeitos distintos, com foco para alterações na abundância relativa de espécies Gram-negativas e nos níveis de ácidos gordos de cadeia curta (SCFA). Três grupos foram alimentados por um período de 10 semanas com 3 tipos de dieta: standard, rica em glucose ou rica em frutose. Periodicamente, recolheram-se amostras fecais e o perfil microbiológico analisado por real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Os metabolitos fecais foram analisados por ressonância magnética nuclear de protão (1H NMR). Observaram-se diferenças significativas no conteúdo em metabolitos com uma redução, induzida por frutose, em SCFA benéficos como o butirato. Nos animais alimentados com elevados níveis de frutose, moléculas não metabolizadas deste açúcar foram encontradas nas fezes, indicando uma saturação da absorção intestinal que resulta em maior disponibilidade de frutose para o microbioma. No mesmo grupo de ratinhos verificou-se uma alteração na composição microbiana com maior tendência para espécies Gram-negativas e um decréscimo nas concentrações de butirato em relação a acetato e propionato. A prevalência destas bactérias pode promover inflamação visceral pelo seu crescimento e libertação de endotoxinas do lúmen intestinal para os tecidos circundantes. Adicionalmente, variações nos metabolitos bacterianos como lactato e SCFA podem alterar o metabolismo intestinal, hepático e periférico através de modificações diretas por substratos, como ativação específica de recetores sensíveis a esses, tais como os da família GPR. Na segunda parte desta Tese, foram determinadas as contribuições específicas da glucose e frutose nas dietas, para a lipogénese no fígado e tecido adiposo, através da integração do enriquecimento nos triglicerídeos (TG) em 2H proveniente de água deuterada para quantificação da lipogénese de novo (DNL) e síntese de glicerol gerais, com o enriquecimento nos mesmos TG em 13C proveniente de marcadores 13C-glucose e 13C-frutose para analisar as contribuições específicas destes açúcares exógenos. No fígado, a frutose deteve um contributo significativamente superior para a DNL e síntese de glicerol quando comparada com glucose. Neste contexto, a frutose promoveu a produção de ácidos gordos saturados em maior escala, efeito não verificado com a glucose. No tecido adiposo mesentérico a frutose contribuiu para a síntese de TG embora em menor porção que a glicose. No tecido adiposo subcutâneo apenas a glicose contribuiu para a lipogénese. Em nota conclusiva, esta dissertação apresenta novas evidências no papel do intestino e tecido adiposo visceral no metabolismo da glicose e frutose e estabelece bases para duas novas linhas de investigação. A primeira reporta à saturação de frutose no intestino grosso: em que medida este fenómeno ocorre em humanos sob dietas ocidentais e a influência que terá na composição do microbioma e metabolismo? Existem evidências de que a malabsorção de frutose em humanos poderá ser transversal a um grupo maior de populações que inicialmente esperado. A segunda refere-se à utilização dos carbonos da frutose para lipogénese no tecido adiposo mesentérico em que se questiona por que processo este açúcar fica disponível aos adipócitos. Por via de absorção direta ou através de gluconeogénese intestinal por conversão prévia a glicose? Se se verificar a absorção direta, será demonstrado que os adipócitos mesentéricos são capazes de assimilar e metabolizar frutose inferindo que o tecido adiposo mesentérico possui, em alguma medida, um acesso privilegiado a nutrientes absorvidos pelo intestino.