Establishment and Characterization of Human Pluripotent Stem Cells derived Brain Organoids

Abstract

Doença de Machado-Joseph (DMJ), ataxia espinocerebelar do tipo 3, é uma doença genética de neurodegeneração progressiva, que pertence à classe de doenças poliglutamínicas, sendo a mais comum ataxia espinocerebelar poliglutamínica no mundo. A DMJ tem origem numa mutação do gene ATXN3, no qual está presente um número aumentado de repetições do trinucleotido CAG, resultando num trato de poliglutaminas extendido na proteína ataxina-3. Esta proteína mutada está envolvida em diversos mecanismos patológicos. A DMJ é caracterizada pela presença de inclusões intracelulares de ataxina-3 mutada e extensa morte neuronal em diversas regiões do cérebro, sendo o cerebelo a região mais afetada. Presentemente, ainda não existe uma cura para a doença ou um tratamento que abrande a progressão da doença.Nos últimos anos, diferentes terapias foram desenvolvidas e testadas em modelos celulares e modelos animais. Para além do reduzido número de modelos estabelecidos, estes apresentam algumas desvantagens: i) os modelos celulares não conseguem mimetizar a real complexidade dos tecidos assim como o ambiente fisiológico; ii) enquanto que para modelos animais, a translação terapêutica para a clínica pode ser difícil, principalmente quando o alvo se trata de órgãos tão complexos como o cérebro.O estabelecimento de células estaminais humanas pluripotentes induzidas, que apresentam grande potencial de diferenciação em qualquer tipo celular do corpo humano, permitiu o desenvolvimento de novos modelos in vitro. Portanto, células estaminais humanas pluripotentes induzidas derivadas de células de doentes e seus derivados (células estaminais neuroepiteliais) são atualmente bastante utilizadas para modelos in vitro.Organoides são estruturas 3D produzidas in vitro, capazes de se auto organizarem até certo ponto e assemelham-se, em parte, órgãos in vivo. Recentemente, protocolos para gerar organoides de cérebro têm sido desenvolvidos, incluindo protocolos para organoides cerebrais, mesencéfalo/cérebro posterior, prosencefalo e cerebelo. No presente trabalho, células estaminais humanas pluripotentes induzidas derivadas de células de indivíduos com DMJ e indivíduos saudáveis, assim como células estaminais neuroepiteliais destas derivadas já estabelecidas anteriormente, foram utilizadas como ponto de partida para gerar organoides cerebrais e de mesencéfalo/cérebro posterior.Organoides cerebrais, derivados de células estaminais humanas pluripotentes induzidas de doentes e de indivíduos saudáveis foram gerados e caracterizados. Marcadores de pluripotencia (Nanog), multipotentes/neuroectoderme (PAX6 e NESTIN), diferenciação neuronal (NEUROD1), neuronais (β3-Tubulin, MAP2 e NeuN), glia (GFAP e s100β) e de células neuronais relacionadas com o cerebelo (ATOH1 e TBR1) foram avaliados por qRT-PCR e imunohistoquimica. Os nossos resultados vão ao encontro de padrões de expressão destes marcadores durante o desenvolvimento embriónico, uma vez que, foram observados decréscimos em marcadores de pluripotencia (Nanog), aumentos em marcadores de pluripotência (PAX6) e de marcadores de glia (GFAP e S100β) durante a maturação dos organoides. A funcionalidade neuronal foi avaliada, com resultados preliminares a indicar que os organoides apresentam neurónios funcionais, e que organoides derivados de células estaminais humanas pluripotentes induzidas de doentes apresentam uma menor quantidade de neurónios funcionais, assim como uma menor intensidade de resposta.O mesmo foi observado em organoides derivados de células estaminais neuroepiteliais derivadas de células estaminais humanas pluripotentes induzidas. Apresentando um perfil semelhante em termos de marcadores multipotentes/neuroectoderme (PAX6 e NESTIN), neuronais (β3-Tubulin e MAP2), glia (GFAP e s100β) e de células neuronais relacionadas com o cerebelo (ATOH1). Interessantemente, marcadores de células de purkinje foram observados nestes organoides. Adicionalmente, também agregados foram encontrados nestes organoides derivados derivados de células estaminais neuroepiteliais derivadas de células estaminais humanas pluripotentes induzidas de doentes. A nível de funcionalidade, as mesmas conclusões foram retiradas.Concluindo, ambos os protocolos permitem desenvolver organoides com grande potencial para serem utilizados como modelos da doença.

Machado–Joseph disease (MJD), or spinocerebellar ataxia type 3 (SCA3), is a rare inherited progressive neurodegenerative disorder that belongs to the class of polyglutamine (polyQ) diseases being the most common autosomal dominant polyQ spinocerebellar ataxia in the world. MJD arises from a mutation in the ATXN3 gene, in which an increased number of the cytosine-adenine-guanine (CAG) trinucleotide results in a lengthened polyQ tract in Ataxin-3 protein. This mutant Ataxin-3 is involved in several pathological mechanisms. MJD is characterized by the presence of neuronal intracellular mutant Ataxin-3 inclusions and extensive neuronal death in diverse brain regions, with the cerebellum being the most affected region. Presently there is no effective treatment to cure or delay MJD progression. In the last years, different therapeutic approaches have been developed and tested in cellular and animal models. Besides the small number of established models, these have some disadvantages: i) cellular models do not mimic real tissue complexity and physiological environment, ii) while for animal models the therapeutic translation might be difficult, namely when complex organs such as the brain are targeted. The establishment of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that hold the potential to differentiate into any cell from the human body, allowed the development of new in vitro models. Therefore, disease-specific hiPSCs and their derived cells (e.g. Neuroepithelial Stem Cells (NESCs)) are now widely used for in vitro disease modeling. Organoids are in vitro-derived 3D structures that undergo some level of self-organization and resemble, at least in part, in vivo organs. Recently, protocols for the generation of human brain-like organoids have been developed, including protocols for whole-brain, midbrain/hindbrain, cerebellar, and forebrain regions. In the present work human control and MJD iPSC and iPSC-derived NESC already established and characterized in our lab were used to establish and characterize whole-brain and midbrain/hindbrain organoids.Human whole-brain organoids derived from control and MJD iPSC were developed and characterized. Pluripotency (Nanog), multipotent/neuroectodermal (PAX6 and NESTIN), neuronal differentiation (NEUROD1), neuronal (β3-Tubulin, MAP2 and NeuN), glial (GFAP and s100β), and cerebellum-related neuronal (ATOH1 and TBR1) markers were evaluated through qRT-PCR and immunohistochemistry. Our data is in agreement with the expression patterns of these markers during embryonic development, given that it was observed a decrease in pluripotent marker Nanog, and increase in multipotent marker PAX6 and in glial markers GFAP and S100β during organoids maturation. Single cell calcium imaging preliminary data showed that the organoids present functional neurons and that MJD organoids have a reduced cell response intensity and percentage of cells responding as neurons. Concerning to MJD-associated neuropathological hallmarks, besides the impairments in neuronal functionality, it was also detected the presence of mutant ataxin-3 aggregates in MJD organoids.Midbrain/hindbrain organoids generated from iPSC-derived NESCs shown similar profile of multipotent/neuroectodermal (PAX6 and NESTIN), neuronal (β3-Tubulin and MAP2), glial (GFAP and S100β) and cerebellum-related neuronal (ATOH1) markers as observed for whole-brain organoids. Interestingly, Purkinje cell marker PCP4 was detected in iPSC-derived NESCs specific-derived organoids, which was not observed in human whole-brain organoids. Concerning the MJD-associated neuropathological hallmarks presence in this model, the established MJD midbrain/hindbrain organoids also present mutant ataxin-3 aggregates, which were detected at day 40. Moreover, single cell calcium imaging analysis also showed that the organoids have functional neurons, with MJD organoids presenting a slightly decrease tendency in both cell response intensity and percentage of cells responding as functional neurons.In conclusion with both protocols, the developed organoids have potential to be used as MJD models, presenting important hallmarks of the disease, namely the presence of mutant ataxin-3 aggregates and impaired neuronal functionality.