Patient-specific iPSC-derived NESC for Machado-Joseph Disease treatment

Abstract

A Doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida como Ataxia Espinocerebelosa Tipo 3, é uma doença neurodegenerativa autossómica dominante sem cura, cujos sintomas são de início tardio. Esta doença é causada por uma expansão anormal de repetições do tripleto CAG no gene MJD1/ATXN3, resultando numa proteína – ataxina-3 – com uma sequência de poliglutamina anormalmente longa. Esta mutação confere à ataxina-3 um ganho de função tóxico, que está na base do desencadeamento de complexos mecanismos patogénicos causadores de disfunção e morte celulares. Os doentes DMJ apresentam sintomas motores e não-motores associados a alterações neuropatológicas. Geralmente, aquando do diagnóstico, já terá ocorrido uma perda neuronal extensa. Portanto, a substituição celular será necessária em estratégias terapêuticas efetivas para o tratamento destes doentes. Num estudo recente, o transplante de células estaminais neurais (NSC) de murganho mostrou reduzir significativamente a neuropatologia associada à DMJ, aliviar de forma robusta os défices motores e ativar efeitos neuroprotetores num modelo animal transgénico de DMJ. Assim, é necessário desenvolver e testar fontes celulares humanas para terapias efetivas baseadas no transplante de células no cérebro. Através da tecnologia que permite gerar células estaminais pluripotentes induzidas (iPSC), é possível implementar terapias personalizadas, reprogramando células somáticas do doente em células estaminais para transplante autólogo. As células estaminais neuroepiteliais (NESC) são células multipotentes capazes de originar todas as células do sistema nervoso e podem ser originadas através da indução neural de iPSC. Neste estudo, cerebelos de murganhos NOD/SCID foram avaliados, 6 meses após terem sido transplantados com NESC derivadas de iPSC de indivíduos controlo (NESC CNT) ou de doentes MJD (NESC MJD), a fim de testar a sobrevivência, segurança e comportamento das células no microambiente do cerebelo do hospedeiro. Os nossos resultados revelam que, tanto NESC CNT como NESC MJD, sobrevivem, migram e diferenciam-se em neurónios e astrócitos, formam conexões sinápticas excitatórias e inibitórias com as células do hospedeiro, e não resultam em crescimento excessivo do transplante. Adicionalmente, os efeitos terapêuticos bystander descritos mediados por células estaminais também foram avaliados. Os nossos dados demonstram que as células NESC CNT foram capazes de aumentar significativamente os níveis de fatores neurotróficos e de proteínas relacionadas com a neurogénese no cerebelo do hospedeiro, o que indica que estas células podem promover efeitos benéficos através do seu secretoma. NESC CNT e NESC MJD promoveram efeitos semelhantes em termos de recrutamento de microglia e astrogliose em todo o cerebelo, apesar de se ter observado que as células NESC MJD recrutaram significativamente mais astrócitos para a zona do transplante, comparativamente às células NESC CNT, o que provavelmente está relacionado com a descrita astrogliose promovida pela ataxina-3 mutante. Finalmente, foi desenvolvida e testada uma estratégia baseada em vetores lentivirais, com o objetivo de silenciar a ataxina-3 mutante nas células a serem transplantadas. Foram obtidos níveis significativamente diminuídos de Mut ATXN3 mRNA em fibroblastos de doentes infetados com os vetores lentivirais codificando um short-hairpin contra esse Mut ATXN3 mRNA. No geral, estes resultados demonstram que as NESC derivadas de iPSC têm potencial para serem usadas numa abordagem de substituição celular e neuroproteção para tratamento da DMJ.

Machado-Joseph disease (MJD), also known as Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3), is an incurable dominantly inherited neurodegenerative disorder of late-onset. This disease is caused by an abnormal expansion of the CAG trinucleotide repeat in the MJD1/ATXN3 gene, resulting in an ataxin-3 protein with an abnormally long polyglutamine tract. The mutation confers to ataxin-3 a toxic gain of function underlying complex pathogenic mechanisms that cause cellular dysfunction and death. MJD patients present motor and non-motor symptoms associated with the neuropathological alterations, and generally, by the time of diagnosis already has occurred extensive neuronal loss. Therefore, effective therapeutic strategies for MJD patients will require cell replacement. In a recent study, transplantation of murine neural stem cells (NSC) was shown to significantly reduce MJD-associated neuropathology, to robustly alleviate motor impairments and to trigger neuroprotective effects in a transgenic MJD mouse model. Thus, it is necessary to develop and test human cell sources to be used in effective brain cell transplantation therapies. Through the iPSC (induced pluripotent stem cell) technology it is possible to implement personalized therapies, reprogramming somatic cells of the patient into stem cells for autologous transplantation. Neuroepithelial stem cells (NESC) are multipotent cells able to originate all cells of the nervous system and can be obtained by neural induction of iPSC. In this study, cerebella of NOD/SCID mice, 6 months after being transplanted with control (NESC CNT) or MJD (NESC MJD) iPSC-derived NESC, were evaluated for graft survival, safety, and behaviour in the host cerebellum microenvironment. Our results reveal that both NESC CNT and NESC MJD survive, migrate and differentiate into neurons and astrocytes, form excitatory and inhibitory synaptic connections with host cells and result in no graft overgrowth. Moreover, the described bystander therapeutic effects mediated by stem cells were also assessed. Our data demonstrate that NESC CNT were able to significantly enhance both neurotrophic factors and neurogenesis-related protein levels in the host cerebellum, which indicates that these cells may promote beneficial effects through their secretome. NESC CNT and NESC MJD promoted similar effects in microglial recruitment and astrogliosis in all cerebellum; however, NESC MJD were found to recruit significantly more astrocytes near the transplant site, compared to NESC CNT, which is probably related to the described astrogliosis promoted by the mutant ataxin-3 protein. Finally, a lentiviral vector-based strategy was developed and tested with the goal of silencing mutant ataxin-3 in the cells to be transplanted. A significant reduction on the levels of Mut ATXN3 mRNA in patient fibroblasts infected with the lentiviral vectors encoding for mutant ATXN3 short-hairpin was also observed. Overall, these results demonstrate that iPSC-derived NESC have potential to be used as a cell-replacement and neuroprotective approach for MJD treatment.