Analysis of the impact of mushroom compounds on neuronal ROS production

Abstract

Presently, the rapid rate of growth of the affected population with premature aging and numerous diseases is evident being cancer and neurodegenerative diseases, such as Alzheimer's, Parkinson's and amyotrophic lateral sclerosis, the most prevalent and requiring more attention. One of the main causes for the onset of these diseases is the uncontrolled production of reactive oxygen species (ROS), derived from an excessive production of free radicals. In order to reduce oxidative damage and considering the restrictions on the use of synthetic antioxidants, there is an increasing demand for natural products that contain a high antioxidant potential.Among the existing natural products, mushrooms have been the subject of countless studies, due to their beneficial effects on health in addition to their nutritional properties. These are fungi quite rich in bioactive compounds, such as polysaccharides, phenolic compounds, vitamins and secondary metabolites. Some of the referred compounds have numerous antioxidant properties that are very beneficial to the organism. This master's thesis project is focused on the study of the Tricholoma equestre mushroom species, which has not been much studied until now. The scope of the work was to investigate the effect of polysaccharides and of phenolic compounds, extracted from Tricholoma equestre species, on the production of ROS in neuronal cells. The experiments were performed in brain slices from Wistar rats, at the mossy fiber synapses from CA3 hippocampal area. Polysaccharides and phenolic compounds extracts obtained from the Tricholoma mushroom, were used to prepare different solutions with concentrations of 0.1, 0.5 and 1 g.L-1, by adding the extracts to the artificial cerebrospinal fluid (ACSF), which has the composition of the neuronal extracellular medium. The aim of this part of the work was to study the effect of those compounds on neuronal ROS production using the fluorescent ROS indicator H2DCFDA.The results show that the lower polysaccharides concentrations (0.1 and 0.5 g.L-1) did not cause significant ROS changes while the higher dose (1 g.L-1) led to a decrease of the ROS signals of about 2.7 % with respect to the baseline. The experiments carried out with the phenolic compounds solutions gave more accentuated changes that were opposite to the previous one. The larger increases in ROS production were observed for the concentrations of 0.1 and 1 g.L-1, having the fluorescence signals amplitudes of about 18 % and 14 %, respectively, while for 0.5 g.L-1 the enhancement was approximately 6 %. These facts indicate that the phenolic compounds have a peculiar concentration dependent effect, occurring the larger ROS changes for the lower concentration, 0.1 g. L-1, whose signals have a similar profile to that of the higher concentration, 1 g. L-1.The last group of experiments was made with the synthetic compound, 4-hydroxybenzoic acid (1 g.L-1), which is the only identified phenolic compound of the studied mushroom species. The results indicate that this acid causes similar changes to those observed for the same concentration of the phenolics extract, with a maximum value of about 14 % upon the removal of the acid.In conclusion, and due to the obtained results, it is undeniable that mushrooms have antioxidant properties that affect the performance of cellular metabolism, acting on ROS signals and triggering different responses of the organism to these stimuli.

Atualmente, é evidente a rápida taxa de crescimento da população afetada com envelhecimento prematuro e por numerosas doenças como o cancro e doenças neurodegenerativas, tais como as doenças de Alzheimer, de Parkinson e a esclerose lateral amiotrópica, que são as mais frequentes e que requerem mais atenção. Uma das causas principais para o início destas doenças é a produção descontrolada de espécies reativas de oxigénio (ROS), derivadas da produção excessiva de radicais livres. De forma a reduzir danos oxidativos e considerando a restrição no uso de antioxidantes sintéticos, verifica-se uma procura crescente de produtos naturais com um elevado potencial antioxidante. Entre os produtos naturais existentes os cogumelos têm sido objeto de inúmeros estudos devido aos seus efeitos benéficos na saúde para além das suas propriedades nutricionais. Estes são fungos muito ricos em compostos bioativos, tais como polissacarídeos, compostos fenólicos, vitaminas e metabolitos secundários. Alguns dos compostos referidos tem muitas propriedades antioxidantes que são muito benéficas para o organismo. Este projeto de tese de mestrado foca-se no estudo da espécie de cogumelos Tricholoma equestre que, até à data, não tem sido muito estudado. O objetivo do estudo era investigar o efeito de polissacarídeos e de compostos fenólicos, extraídos da espécie Tricholoma equestre, na produção de ROS em células neuronais. As experiências foram realizadas em fatias cerebrais de ratos Wistar nas sinapses das fibras musgosas da área CA3 do hipocampo. Extratos de polisacarídeos e de compostos fenólicos, obtidos do cogumelo Tricholoma, foram usados para preparar diferentes concentrações de 0.1, 0.5 e 1 g.L-1, adicionando os extratos ao fluído cerebroespinal artificial (ACSF), que tem a composição do meio neuronal extracelular. O objetivo desta parte do trabalho era estudar o efeito daqueles compostos na produção de ROS neuronal usando o indicador de ROS fluorescente H2DCFDA.Os resultados mostram que as concentrações mais baixa de polissacarídeos (0.1 and 0.5 g.L-1) não causaram variações significativas de ROS enquanto que a dose mais alta (1 g.L-1) levou a uma diminuição dos sinais de ROS de cerca de 2.7 % em relação à linha base. As experiências realizadas com as soluções de compostos fenólicos originaram variações mais acentuadas que eram opostas à anterior. Os maiores aumentos na produção de ROS foram observados para as concentrações de 0.1 e 1 g.L-1, tendo os sinais de fluorescência respetivamente amplitudes de cerca de 18 % e 14 %, enquanto que para 0.5 g.L-1 o aumento era aproximadamente 6 %. Estes factos indicam que os compostos fenólicos têm um efeito dependente da concentração que é peculiar, ocorrendo as maiores variações de ROS para a menor concentração, 0.1 g.L-1, cujos sinais têm um perfil semelhante aos da concentração mais elevada, 1 g. L-1. O último grupo de experiências foi feito com o composto sintético 4-hydroxybenzoic acid (1 g.L-1), que é o único composto fenólico identificado na espécie de cogumelos estudada. Os resultados indicam que este ácido causa variações de ROS semelhantes às que foram observadas para a mesma concentração do extrato de fenólicos, com um valor máximo de cerca de 14 % após a retirada do ácido.Em conclusão, e pelos resultados obtidos, é inegável que os cogumelos possuem propriedades antioxidantes que afetam o desempenho de metabolismo celular, atuando nos sinais de ROS e desencadeando diferentes respostas do organismo a estes estímulos.