Investigation of mutant ataxin-3 spreading in Machado-Joseph Disease

Abstract

A ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3), também conhecida como doença de Machado-Joseph (MJD), é uma doença neurodegenerativa hereditária autossómica dominante. Esta doença é devida a uma mutação no gene MJD1/ATXN3 envolvendo um aumento do número de repetições no codão CAG, que se traduz numa expansão de poliglutaminas na proteína Ataxina-3. O gene mutado apresenta 55-87 repetições CAG, enquanto o gene normal tem 10-51 repetições. A MJD caracteriza-se pela presença de inclusões intranucleares e extensa morte neuronal, afetando diversas regiões cerebrais, particularmente o cerebelo. Clinicamente, os doentes apresentam vários sintomas, como comprometimento da coordenação motora, disartria e disfagia. Atualmente, não há terapia disponível para interromper ou atrasar a progressão da doença.Existem vários estudos que comprovam a disseminação de proteínas aberrantes associadas a doenças neurodegenerativas entre várias regiões do Sistema Nervoso Central. Vesículas extracelulares (EVs), como exossomas, microvesículas e corpos apoptóticos, demonstraram nos últimos anos envolvimento em várias patologias, em particular, doenças neurodegenerativas. As EVs têm sido associadas à disseminação de proteínas aberrantes em doenças como a doença de Creutzfeld-Jacob, a doença de Huntington ou a doença de Alzheimer. Foi proposto que a disseminação “infeciosa” de proteínas mutantes pode desempenhar um papel crucial na morte neuronal e progressão da doença.Para estudar este processo, é atualmente possível utilizar Células-estaminais pluripotentes induzidas (iPSCs), obtidas pela reprogramação de células somáticas. As iPSCs revolucionaram o campo dos modelos de doença, na medida em que permitem o acesso a neurónios dos doentes, portanto com toda informação genética do doente, o que lhes confere particular relevância fisiológica. Neste trabalho as EVs testados foram obtidas de células-estaminais neuroepiteliais derivadas de iPSCs (NESCs), e de culturas neuronais derivadas de NESCs de indivíduos controlo e de doentes de MJD.O presente trabalho teve como objetivo investigar se a neuropatologia da MJD é disseminada pelo cérebro por meio de EVs, o que poderá promover a agregação de Ataxina-3 mutante, neuroinflamação, mediadores apoptóticos e alterações da autofagia, desencadeando morte neuronal em regiões distantes do cérebro, contribuindo para o agravamento da neuropatologia. Para testar esta hipótese, na primeira tarefa, EVs derivadas de NESCs controlo e MJD foram submetidas a uma caracterização física (tamanho, forma, concentração) e de conteúdo (tais como marcadores de autofagia, marcadores de inflamação, níveis de Ataxin-3 mutantes, marcadores apoptóticos), com o intuito de avaliar potenciais diferenças entre EVs derivados de células controlo e de células MJD.A segunda tarefa teve como objetivo testar a hipótese das EVs funcionarem como veículos de propagação de Ataxina-3 mutante e de fatores agravantes da neuropatologia. Para isso, foram adicionadas EVs derivadas de NESCs de doentes de MJD a culturas neuronais derivadas de iPSCs de indivíduos controlo. Em seguida, os níveis de Ataxina-3 mutante, de autofagia e de mediadores apoptóticos foram avaliados nessas células neuronais, a fim de avaliar se as EVs de doentes MJD conseguem induzir neuropatologia em células controlo. Além disso, nesta tarefa, também averiguámos se o contato celular é necessário para a formação de inclusões de Ataxina-3 mutante e o agravamento da neuropatologia.Na terceira tarefa, investigámos se a disseminação de Ataxina-3 mutante ocorre in vivo. Com esta finalidade, NESCs derivadas de iPSCs foram transplantadas no cerebelo de murganhos e foi avaliada a presença de inclusões de Ataxina-3 mutantes fora do enxerto.O nosso trabalho sugere que poderão existir diferenças físicas e fisiológicas entre EVs derivadas de doentes de MJD e controlos. Observámos também diferenças em processos celulares relevantes após a incubação com EVs derivadas de doentes MJD e controlos. Finalmente, concluímos que a disseminação da Ataxina-3 mutante poderá ocorrer tanto in vitro como in vivo.

Spinocerebellar Ataxia Type 3 (SCA3), also known as Machado-Joseph Disease (MJD), is an inherited autosomal dominant neurodegenerative disease. This disease arises from a mutation in the MJD1/ATXN3 gene, in which an increased number of CAG repeats result in an expanded polyglutamine tract in the Ataxin-3 protein. The mutated gene presents 55-87 CAG repeats, while the normal gene has 10-51 repeats. Pathologically, MJD is characterized by the presence of neuronal intranuclear inclusions and extensive neuronal death, affecting diverse brain regions, particularly the cerebellum. Clinically, the patients present several symptoms such as impaired motor coordination, dysarthria and dysphagia. Presently there is no therapy available to stop or delay the progression of this disease.Evidence for the neuropathological spreading of aberrant, disease-causing proteins across the brain exist. Extracellular vesicles (EVs), such as exosomes, microvesicles and apoptotic bodies, rouse in recent years as playing an important role in several diseases, in particular, neurodegenerative diseases. EVs have been linked to the spreading of aberrant proteins in diseases such as Creutzfeld-Jacob disease, Huntington´s disease and Alzheimer´s disease. It is hypothesized that “infectious spread and seeding” of mutant proteins may play a crucial role in neuronal death and disease progression.To test this hypothsesis, induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs), obtained by reprogramming somatic cells, can be used, iPSCs came to revolutionize the field of disease modeling in a way that researchers have now access to patient’s neurons and are able to work with all the genetic background related to the diseases. In this work the tested EVs were obtained from control and MJD-patient´s iPSCs-derived neuroepithelial stem cells (NESCs), and their differentiated neural cultures.The present work aimed at investigate whether MJD neuropathology is spread through the brain via EVs, which may promote seeding of mutant Ataxin-3, neuroinflammation, apoptotic mediators and autophagy alterations, triggering mutant Ataxin-3 aggregation and neuronal death in distant brain regions and so contributing for neuropathology aggravation. To test this hypothesis, in the first task, EVs derived from control NESCs and MJD NESCs were submitted to a physical (e.g. size, shape, concentration) and content (e.g. autophagy markers, inflammation markers, mutant Ataxin-3 levels, apoptotic markers) characterization in order to evaluate potential differences between control and MJD patient-derived EVs.The second task aimed to test the hypothesis of EVs being the spreading vehicles of mutant Ataxin-3 and neuropathology aggravation factors. For this, MJD NESCs-derived EVs were added to control cultures of human iPSCs-derived neurons. Then, mutant Ataxin-3 inclusions, autophagy and apoptotic mediators levels were evaluated in these cells in order to assess if EVs from MJD patients can deliver disease causing factors to control “healthy” cells. Moreover, in this task we also investigated whether cellular contact is needed to seed mutant Ataxin-3 inclusions and aggravation of neuropathology.In the third task, we investigated whether neuropathological seeding occurs in vivo. For this, MJD iPSCs-derived NESCs were transplanted into the cerebellum of mice and it was assessed the presence of mutant Ataxin-3 inclusions outside the graft.In general, our research hint physical as well as physiological differences between MJD and control-derived EVs. We also observed differences in key cellular processes upon incubation with MJD and control-derived EVs. Finally we concluded that mutant Ataxin-3 spreading occurs both in vitro and in vivo.