Síntese e estudo de novos fotossensibilizadores com potencial para terapia antimicrobiana

Abstract

O crescente aparecimento de casos de bactérias multi-resistentes, para os quais a indústria farmacêutica oferece poucas soluções, tem levado à necessidade de síntese de novas entidades químicas com mecanismos de ação preferencialmente diferentes aos actualmente disponíveis no mercado. A inativação fotodinâmica (PDI) combina o uso de um fotossensibilizador com uma fonte de luz apropriada, tendo-se revelado uma alternativa terapêutica promissora. As ftalocianinas, pelas suas boas propriedades fotofísicas e fotoquímicas, nomeadamente no que diz respeito à sua elevada absorção na janela fototerapêutica (650-900 nm) e elevado rendimento quântico de formação de oxigénio singuleto têm sido estudadas em processos de inativação de microorganismos, nos quais os seus derivados catiónicos demonstram maior atividade e seletividade. O trabalho apresentado nesta dissertação diz respeito à síntese, caracterização estrutural e estudos fotofisicos, fotoquímicos e biológicos de novas ftalocianinas com potencial para PDI. No capítulo 1 são abordados a origem e os mecanismos envolvidos na resistência antimicrobiana. De seguida, são apresentadas as propriedades dos macrociclos tetrapirrólicos, em particular das ftalocianinas, e os mecanismos associado à PDI. São ainda discutidas as propriedades ideais para um fotossensibilizador mediante uma análise das estruturas dos alvos terapêuticos e de resultados previamente reportados na literatura. No capítulo 2 são discutidos os métodos de síntese e caracterização estrutural de dois ftalonitrilos e oito ftalocianinas, das quais cinco são catiónicas. Esta família de metaloftalocianinas catiónicas foi idealizada com o propósito de efectuar um estudo de estrutura/propriedades e estrutura/actividade ao nível de influência de três características: tamanho da cadeia cationizante, grau de cationização e modelação do metal central. Em primeiro lugar, são explorados os métodos de modelação de ftalonitrilos a partir do 4-nitroftalonitrilo e respectiva caracterização estrutural dos produtos. Foram obtidos o 4-(1’H-imidazol-1’-il)ftalonitrilo (56%) e o 4-(2’-metil-5’-nitro-1’H-imidazol-1’-il)ftalonitrilo (54%) utilizando o imidazol e o 2-metil-4(5)nitroimidazol como nucleófilos, respetivamente. Partindo do ftalonitrilo substituído com o grupo imidazol, foram sintetizadas três metaloftalocianinas com Zn(II), In(III) e Al(III) mediante a sua ciclotetramerização com Zn(OAc)2 (71%), InCl3 (67%), e AlCl3 (60%), respectivamente. Neste trabalho são ainda descritos os métodos utilizados para a cationização das três metaloftalocianinas com iodoetano e da metaloftalocianina com Zn(II) com iodooctano e cloreto de (2-cloroetil)trimetilamónio. No capítulo 3 são exploradas as bases para a compreensão dos fenómenos fotofísicos e fotoquímicos mais relevantes em macrociclos tetrapirrólicos. Numa primeira fase são apresentados os espectros de UV-Vis de todas as metaloftalocianinas sintetizadas no capítulo 2 e discutida a influência do metal central, tamanho da cadeia cationizante e grau de cationização no máximo de absorção e nos valores de absortividade molar. Na sua generalidade, as metaloftalocianinas apresentaram valores de absortividae molar relativos à sua banda Q superiores a 10^-5 M^-1 cm^-1, com máximos de absorção a se situarem nos 677-698 nm. Foram efetuados estudos de fluorescência através da recolha de espectros de excitação e emissão e cálculo dos rendimentos quânticos de fluorescência de todas as metaloftalocianinas sintetizadas. Os valores de ΦF obtidos para os complexos de Al(III) foram os mais altos (0,23-0,30) e para os de In(III) os mais baixos (0,01-0,02). De seguida, foi efetuado o estudo dos rendimentos quânticos de oxigénio singuleto recorrendo a um método comparativo. Os complexos de Zn(II) demonstraram maiores valores de produção de oxigénio singuleto (0,56-0,72) e os complexos de Al(III) os piores resultados (0,32-0,33). As metaloftalocianinas de Zn(II) cationizadas com iodoetano e iodooctano foram alvo de estudos in vitro, o que permitiu avaliar o efeito do aumento da cadeia alquílica na atividade/citotoxicidade. A metaloftalocianina de Zn(II) cationizada com a cadeia mais curta demonstrou menor citotoxicidade no escuro (viabilidade celular próxima de 100% até 10 uM) para células HeLa e HaCaT, bem como uma maior taxa de inativação de bactérias gram-negativas (E. coli e P. aeruginosa), tendo sido possível uma inativação completa de colónias destas bactérias com concentrações a partir de 0,1 uM. No capítulo 4 são efetuadas as principais conclusões dos resultados apresentados nesta dissertação. No capítulo 5 são reportados os procedimentos experimentais envolvidos na síntese e caracterização estrutural dos compostos descritos nesta dissertação, bem como os respetivos estudos fotofísicos, fotoquímicos e biológicos efetuados.

The increasing emergence of drug multi-resistant bacteria, for which the pharmaceutical industry offers few solutions, has led to the need of the development of new chemical entities with action mechanisms preferably different to commercially available drugs. Photodynamic inactivation (PDI), which combines the use of a photosensitizer with an appropriate light source, has shown to be a promising alternative therapy. Phthalocyanines, due to their good photophysical and photochemical properties, namely regarding their high absorption in the phototherapeutic window (650-900 nm) and high singlet oxygen quantum yield, have been studied for the inactivation of microorganisms, where their cationic derivatives have shown higher activity and selectivity. The work presented in this dissertation concerns the synthesis, structural characterization and photophysical, photochemical and biological studies of new phthalocyanines with potential for use in PDI. In chapter 1 the origin and the mechanisms involved in the antimicrobial resistance are explored. Then, some properties of tetrapyrrolic macrocycles are presented, particularly regarding phthalocyanines and their potential application in PDI. Finally, some of the ideal properties of photosensitizers are discussed by means of a structural analysis of the therapeutic targets and results previously reported in literature. In chapter 2, we describe the synthesis and structural characterization of two phthalonitriles and eight phthalocyanines, from which five are cationic. This family of cationic metallophthalocyanines allowed to perform studies of structure/properties and structure/activity, regarding the influence of three structural features: size of cationizing chain, degree of cationization and central metal modulation. Firstly, the methods of phthalonitrile modulation starting from 4-nitrophthalonitrile are explored and the structural characterization of the respective products is discussed. Using imidazole and 2-methyl-4(5)nitroimidazole as nucleophiles, we obtained 4-(1’H-imidazol-1’-yl)phthalonitrile (56%) and 4-(2’-methyl-5’-nitro-1’H-imidazol-1’-yl)phthalonitrile (54%), respectively. Starting with the imidazole-containing phthalonitrile, three metallophthalocyanines were synthesized with Zn(II), In(III) and Al(III) through its cyclotetramerization with Zn(OAc)2 (71%), InCl3 (67%), e AlCl3 (60%), respectively. In this work the methods used for the cationization of the three metallophthalocyanines with iodoethane and the Zn(II) metallophthalocyanine with iodooctane and (2-chloroethyl)trimethylammonium chloride are described. In chapter 3, we explore the fundamentals for understanding the most relevant photophysical and photochemical phenomena of tetrapyrrolic macrocycles. Initially, the UV-Vis spectra of all metallophthalocyanines, whose synthesis is described in chapter 2, are presented as well as studies of the influence of the central metal, the size of the cationizing chain and the degree of cationization in the absorption maximum and molar absorption coefficients are discussed. In general, the metallophthalocyanines displayed values of molar absorptivity relating to their Q band higher than 10^-5 M^-1 cm^-1, with the absorption maxima in the range of 677-698 nm. Next, fluorescence studies of all synthesized metallophthalocyanines were performed by means of excitation and emission spectra collection and fluorescence quantum yield calculation. The values of ΦF obtained for the complexes with Al(III) were the highest (0.23-0.30) and with In(III) the lowest (0.01-0.02). Then, calculations of singlet oxygen quantum yield were performed using a comparative method. The Zn(II) complexes showed generally higher production of singlet oxygen (0.56-0.72) and the Al(III) complexes the worst results (0.32-0.33). The Zn(II) metallophthalocyanines cationized with iodoethane and iodooctane were subjected to in vitro studies, to evaluate the effect of the alkylic chain in the activity/cytotoxicity. The Zn(II) metallophthalocyanine cationized with iodoethane showed less dark cytotoxicity (cellular viability close to 100% for concentrations until 10 uM) to HeLa and HaCaT cell lines, as well as a higher rate of inactivation of gram-negative cells (E. coli and P. aeruginosa), having displayed full inactivation of colonies in concentrations as low as 0.1 uM. In chapter 4 the main conclusions of the results presented in this thesis are drawn. In chapter 5 the experimental procedures involved in the synthesis and structural characterization of all the compounds described in this dissertation, as well as their respective photophysical, photochemical and biological studies are presented.