The Role of SPCA1 in the Traffic of Glycosylphosphatidylinositol-Anchored Proteins

Abstract

A oligomerização de GPI-APs (Glycosylphosphatidyl-Inositol-Anchored Proteins) é crucial para o correto tráfego destas proteínas para a membrana plasmática de células MDCK (Madin Darby Canine Kidney) polarizadas desempenhando o colesterol e o cálcio, um importante papel na regulação da formação destes clusters no Golgi.Neste projeto, incidimos na SPCA1 (Secretory Pathway Calcium ATPase 1), uma Ca2+-ATPase do Golgi, responsável pelo influxo de Ca2+ para este compartimento, sendo esta a principal bomba de Ca2+ encontrada no trans-Golgi, onde se formam os clusters de GPI-APs.O objectivo deste projeto é revelar o papel da bomba SPCA1 no tráfego de GPI-APs, em células polarizadas.Primeiramente, caracterizámos a localização e expressão endógena da bomba SPCA1, em células MDCK polarizadas e não polarizadas. Descobrimos que, em ambas as condições, esta se encontrava no Complexo de Golgi com maior expressão em células polarizadas comparando com as não-polarizadas.De seguida, para estudar diretamente o envolvimento da SPCA1 no tráfego de GPI-APs, utilizámos linhas celulares estáveis de MDCK que sobrexpressavam uma GPI-AP apical - GFP-FR - e também shscramble (CTRLi) ou shSPCA1 (SPCA1i). Após a realização de imunofluorescências e a consequente aquisição de imagens, revelámos que as células SPCA1i contêm mais GFP-FR intracelularmente que as células CTRLi. Por último, concretizamos uma experiência de exocitose, com intuito de monitorizar o tráfego do GFP-FR desde o Golgi até à membrana plasmática, com vista a evidenciar o atraso do tráfego de GFP-FR, em células SPCA1i, face às células CTRLi. Em suma, os nossos dados demonstram que a SPCA1 poderá ter um papel no controlo do tráfego de GPI-APs - do Golgi para a membrana plasmática -através da regulação dos níveis de cálcio neste compartimento.

Oligomerization of glycosylphosphatidyl-inositol-anchored proteins (GPI-APs) in the Golgi is crucial for the correct sorting of these proteins to the apical plasma membrane of polarized MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cells. Cholesterol and calcium play an important role in the regulation of the clustering of these proteins in the Golgi. In this work, we focus on the Secretory Pathway Calcium ATPase 1 (SPCA1), Golgi Ca2+-ATPase responsible for the uptake of Ca2+ into this compartment. More precisely, SPCA1 is predominantly found and active in the trans-Golgi where clusters of GPI-APs form. The aim of this project is to unravel the role of SPCA1 pump in the trafficking of GPI-APs in polarized cells.We firstly characterized the endogenous SPCA1 localization and expression both in polarized and non-polarized MDCK cells. We found that in both conditions SPCA1 is localized to the Golgi apparatus and we further report that polarized MDCK cells exhibit a higher amount of endogenous SPCA1 compared to non-polarized MDCK cells. Next in order to directly address the involvement of SPCA1 in the trafficking of apical GPI-AP, we used stable MDCK cell line overexpressing an apical GPI-AP, GFP-FR, with either shscramble (CTRLi) or shSPCA1 (SPCA1i). By performing immunofluorescence experiments and confocal acquisition, we revealed that GFP-FR seems to be more localized intracellularly in SPCA1i cells compared to CTRLi cells. Finally, we performed an exocytosis experiment in order to monitor the sorting of GFP-FR from the Golgi to the plasma membrane and highlighted that the traffickinf of GFP-FR is delayed in SPCA1i cells compared to CTRLi cells.Our data indicates that SPCA1 may have a role in controlling the traffic of GPI-APs from the Golgi to the cell surface through the regulation of the levels of Ca2+ in the Golgi.