Dimorphic brain region regulation of microglia morphology and behavioral implication focus on the crosstalk between glucocorticoid and adenosine a2a receptors

Abstract

Synthetic glucocorticoids, such as dexamethasone, are used in pregnancies at risk of premature delivery in order to promote fetal lung maturation. Animal and human studies show that this treatment leads to alterations in the normal growth and deleterious effects in the developing brain and other organs, but the high efficacy of these drugs and the significant decrease in mortality justify their wide use in clinical practice. Previous studies have also shown that exposure to stress, or administration of glucocorticoids during early phases of development, can contribute to the development of neuropsychiatric disorders in adulthood, such as anxiety, depression and addictive behavior. Moreover, studies with animal models using prenatal exposure to glucocorticoids have reported deleterious effects on neurons, such as neuronal apoptosis, synaptic loss and dendritic atrophy. Microglia are cellular elements of the brain innate immune system, responsive to changes in the immune environment, as occurs by exposure to synthetic glucocorticoids, which are immunomodulators. These cells are affected in their morphologic phenotype in conditions of chronic stress and previous work from our laboratory shows that prenatal exposure to dexamethasone alters microglia morphology in the prefrontal cortex, an effect observed at post natal days 1,7 and 90. Notably, the effect of dexamethasone on microglia morphology depends on the gender of the animal. Adenosine is a neuromodulator, which activates different receptor subtypes, namely adenosine A2A receptors, that are implicated in anxiety and depression and are also modulators of microglia morphology and function. Previous in vivo and in vitro data from our laboratory suggest a possible crosstalk between glucocorticoid and adenosine A2A receptors systems in microglial cells. This previous work highlights the gender-specific modulation of microglia and behavior (anxiety and recognition memory) by glucocorticoids and adenosine A2A receptors. In the present work we aimed at further dissecting the crosstalk between glucocorticoids and adenosine A2A receptors, using three different approaches: i) evaluation of the impact of prenatal exposure to dexamethasone in the dorsal hippocampus, in order to clarify if microglia morphology is regulated in a brain region specific manner (comparison with previous results obtained in the prefrontal cortex) and the ability of A2AR blockade to interfere with dexamethasone effects (Chapter 2.1); ii) evaluation of the impact of the global genetic deletion of A2AR on anxiety, cognition (recognition memory) and glucocorticoid receptor levels in prefrontal cortex and hippocampus, regions implicated in behavioral performance in tests chosen for anxiety and cognition assessment (Chapter 2.2); iii) in vitro evaluation of A2AR ability to regulate subcellular translocation of glucocorticoid receptor to the nucleus and the subsequent transcription of inflammatory mediators in a microglia cell line (Chapter 2.3). In Chapter 2.1, using female Wistar rats prenatally exposed to dexamethasone in embryonic days 18 and 19 (1 mg/kg/day, subcutaneously) and chronically treated with an A2AR antagonist (0.1 mg/kg/day, intraperitoneally) for 21 consecutive days before PND 90, we report that prenatal exposure to dexamethasone is associated with long-lasting microglial hyper-ramification in the dorsal hippocampus and that the chronic blockade of A2AR is able to normalize microglia morphology. These results contrast with dexamethasone-induced changes in the prefrontal cortex of females, where we previously described a decrease in the length and in the number of processes, an effect not normalized by the chronic blockade of A2AR at adulthood. Altogether, these results suggest that dexamethasone and A2AR modulate microglia morphology in a brain region-specific manner. In Chapter 2.2, we used female mice with a global genetic deletion of A2AR to further confirm: i) if A2AR modulate anxiety and recognition memory in a gender-specific manner, by comparison with published work in males; ii) if A2AR regulate glucocorticoid receptor levels in the prefrontal cortex and in the hippocampus, as occurs by pharmacological blockade of the receptor. We observed that these mice exhibit anxious-like behavior, without alterations in short-term memory. These results are in accordance with the literature: male knock-outs for this receptor have an anxiety-like phenotype and the pharmacological blockade of the receptor in males was able to recover memory deficits induced by chronic stress. We observed that the global genetic deletion of A2AR does not affect glucocorticoid receptor levels in prefrontal cortex and hippocampus, in opposition to what happens in females chronically treated with an A2AR antagonist in adulthood, that exhibited alterations in the density of glucocorticoid receptor levels in a brain region-specific manner, namely a general decrease in both regions. In Chapter 2.3, we used a microglial cell line to explore a putative mechanism of interaction between glucocorticoid and A2A receptors. In this case, we studied the translocation of the glucocorticoid receptor from the cytoplasm to the nucleus, induced by dexamethasone, in the presence and in the absence of a selective A2AR antagonist. The blockade of A2AR impairs the translocation of glucocorticoid receptor to the nucleus induced by dexamethasone. Interestingly, the exposure to the antagonist of A2AR per se significantly decreased glucocorticoid receptor levels in the cytoplasm and the nucleus, indicating that adenosine, through A2AR, modulate glucocorticoid receptor levels and translocation process in microglial cells. Altogether, this study shows that exposure to glucocorticoids during development causes long-lasting morphological changes in microglial cells in the dorsal hippocampus of females. Moreover, microglia morphology is recovered with the chronic blockade of A2AR in adulthood, pointing towards a crosstalk between these two systems. The in vitro results support this hypothesis, showing that A2AR affects the translocation of the glucocorticoid receptors to the nucleus and the density of these receptors, which may affect glucocorticoid genomic effects.

Os glucocorticóides sintéticos, como a dexametasona, são frequentemente utilizados em situações de gravidez com risco de parto prematuro, com o objetivo de acelerar a maturação pulmonar fetal. Apesar de estudos em animais e humanos demonstrarem que este tratamento leva a um atraso no crescimento e outros efeitos nefastos no cérebro e em outros órgãos em desenvolvimento, a eficácia elevada destes fármacos e a diminuição significativa da mortalidade justifica o seu uso frequente na clínica. Estudos anteriores têm reportado que a exposição ao stress, ou a administração de glucocorticóides durante etapas cruciais do desenvolvimento, contribuem para o aparecimento de distúrbios neuropsiquiátricos, como a ansiedade, depressão e comportamento aditivo. De facto, estudos em modelos animais expostos durante o período pré natal a glucocorticóides reportam efeitos prejudiciais nos neurónios, tais como apoptose neuronal, perda sináptica e atrofia dendrítica. As células da microglia são células do sistema imunitário do cérebro, que respondem a alterações no ambiente celular, como a exposição a glucocorticóides sintéticos (imunomoduladores). Estas células são afetadas no seu fenótipo morfológico em condições de stress crónico, e estudos anteriores do nosso laboratório demonstraram que a exposição pré-natal a dexametasona altera a morfologia da microglia no córtex pré-frontal, um efeito observado nos dias 1, 7 e 90 após nascimento. Notavelmente, o efeito da dexametasona na morfologia da microglia é dependente do género do animal. A adenosina é um neuromodulador que ativa diferentes subtipos de recetores, como os recetores A2A de adenosina, que estão implicados na fisiopatologia da ansiedade e da depressão e também são moduladores da morfologia e função da microglia. Resultados preliminares obtidos in vivo e in vitro no nosso laboratório sugeriram uma possível interação entre os recetores de glucocorticóides e de adenosina A2A, demonstrando uma modulação dependente do género na microglia e no comportamento (ansiedade e memória). Neste trabalho focámo-nos no estudo da interação entre os recetores de glucocorticóides e de adenosina A2A, utilizando três abordagens diferentes: i) avaliação do impacto da exposição pré-natal a dexametasona no hipocampo dorsal, com o objetivo de clarificar se a morfologia da microglia é regulada de uma maneira específica entre regiões do cérebro, comparando com resultados prévios obtidos no córtex pré-frontal e, se o bloqueio dos recetores A2AR é eficaz na reversão dos efeitos mediados pela dexametasona (Capítulo 2.1); ii) avaliação do impacto da deleção genética global dos A2AR na ansiedade, cognição (memória) e níveis de recetores de glucocorticóides no córtex pré-frontal e no hipocampo, regiões implicadas na ansiedade e na cognição, comportamentos avaliados nos testes comportamentais (Capítulo 2.2); iii) avaliação do in vitro a capacidade dos A2AR regularem a translocação subcelular dos recetores de glucocorticóides para o núcleo e subsequente transcrição de mediadores inflamatórios numa linha celular de microglia (Capítulo 2.3). No capítulo 2.1, utilizámos fêmeas de ratos Wistar expostas, no período pré-natal, a dexametasona nos dias embrionários 18 e 19 (1 mg/kg/dia, subcutaneamente) e cronicamente tratados com um antagonista de A2AR (0.1 mg/kg/dia, intraperitonealmente) durante 21 dias consecutivos antes do dia 90 após nascimento. Os animais expostos a dexametasona durante o desenvolvimento apresentaram alterações nas células da microglia (híper-ramificação) do hipocampo dorsal, as quais persistem até à idade adulta, no entanto, o bloqueio crónico dos A2AR foi capaz de normalizar a morfologia da microglia. Estes resultados contrastam com as alterações induzidas pela dexametasona no córtex pré-frontal de fêmeas, onde previamente descrevemos uma diminuição do comprimento e do número de processos, um efeito que não foi normalizado pelo bloqueio crónico dos A2AR na idade adulta. Estes resultados analisados em conjunto, sugerem que a dexametasona e os A2AR modulam a morfologia da microglia de uma maneira dependente da região do cérebro. No capítulo 2.2 foram utilizadas fêmeas com a deleção genética global de A2AR com o intuito de confirmar: i) se a modulação dos A2AR na ansiedade e na memória é dependente do género, por comparação com trabalhos publicados em machos; ii) se os A2AR regulam os níveis de recetores de glucocorticóides no córtex pré-frontal e no hipocampo, como ocorre no caso do bloqueio farmacológico deste recetor. Estes animais exibiram um comportamento ansioso, sem alterações na memória. Estes resultados estão de acordo com o que está descrito na literatura em que machos com a deleção genética global de A2AR possuem um fenótipo comportamental ansioso e o bloqueio farmacológico deste recetor em machos foi capaz de recuperar défices de memória induzidos pelo stress crónico. Por conseguinte, a deleção genética global não teve um impacto nos níveis de recetores de glucocorticóides no córtex pré-frontal e no hipocampo, contrastando com o que foi observado em fêmeas cronicamente tratadas com o antagonista dos A2AR na vida adulta, que exibem alterações na densidade dos recetores de glucocorticóides dependendo da região do cérebro analisada, nomeadamente, uma diminuição em ambas as regiões. No capítulo 2.3 foi utlizada uma linha celular de microglia com o objetivo de explorar os mecanismos de interação entre os recetores de glucocorticóides e de A2AR. Neste caso, o mecanismo estudado foi a translocação do recetor de glucocorticóides do citoplasma para o núcleo, induzido pela dexametasona, na presença e na ausência de um antagonista seletivo dos A2AR. O bloqueio dos A2AR afeta a translocação de recetores de glucocorticóides para o núcleo induzido pela dexametasona. Interessantemente, a exposição ao antagonista dos A2AR per se diminuiu significativamente os níveis de recetores de glucocorticóides no citoplasma e no núcleo, indicando que a adenosina, através da ativação dos A2AR modula os níveis de recetores de glucocorticóides e o seu processo de translocação nas células da microglia. Concluindo, os resultados apresentados indicam que a exposição a glucocorticóides durante o desenvolvimento afeta a morfologia da microglia no hipocampo dorsal de fêmeas, alterações que persistem até à idade adulta. Adicionalmente, a morfologia da microglia foi recuperada com o bloqueio crónico dos A2AR na idade adulta, sugerindo assim, uma interação entre estes dois sistemas. Os resultados in vitro suportam esta hipótese, demonstrando que os A2AR afetam a translocação dos recetores de glucocorticóides para o núcleo e a sua densidade, podendo afetar os efeitos genómicos dos glucocorticóides.