Wound healing and pro-angiogenic properties of LL37-conjugated nanoparticles

Abstract

Problemas de cicatrização de feridas e suas complicações médicas continuam a ser um dos problemas de saúde mais prevalentes e economicamente onerosos do mundo. Nos Estados Unidos, as feridas crónicas afectam 6.5 milhões de pacientes. Mais de 25 bilhões de dólares são gastos anualmente em tratamento de feridas crónicas e a despesa irá crescer rapidamente devido ao aumento dos custos de saúde, o envelhecimento da população e um aumento acentuado na incidência de diabetes e obesidade em todo o mundo. Dados recentes indicam que 11.7% da população Portuguesa é diabética. Uma das complicações mais graves e debilitantes da diabetes é o desenvolvimento de feridas crónicas e não cicatrizantes. Nos últimos anos, tem havido esforços para se desenvolver terapias avançadas para a cicatrização de feridas crónicas, incluindo o uso tópico de factores de crescimentos ou terapias celulares. Infelizmente, em muitos casos, a eficácia terapêutica é baixa, as terapias são caras, requerem aplicação clínica e não possuem actividade antimicrobiana. Portanto, é imperativo o desenvolvimento de novas terapêuticas para responder a esta necessidade clínica. Os péptidos antimicrobianos (AMPs) sintetizados na pele podem constituir futuras terapias já que são moléculas que formam uma barreira à infecção e alguns deles são muito importantes para a regeneração da pele (4). O péptido LL37 é o AMP mais importante na pele, actuando como primeira linha de defesa contra bactérias, vírus, fungos e desempenha um papel importante na imunomodulação, angiogénese e cicatrização de feridas. Recentemente, foram publicados os resultados de um ensaio clínico fase I / II com o péptido LL37 que demonstram a sua eficácia terapêutica em feridas crónicas; no entanto, foram necessárias múltiplas administrações tópicas. O objectivo principal desta tese foi desenvolver uma formulação de nanopartículas conjugadas com LL37 de forma a possuir maior actividade de cicatrização da pele que o péptido livre (não imobilizado). A formulação de nanopartículas foi preparada por uma nova metodologia na qual foi utilizado o péptido LL37 com um terminal tiol, actuando o péptido como agente de revestimento durante a formação da nanopartícula. Esta formulação tem um núcleo de ouro (Au) e um escudo formado pelo péptido catiónico LL37. Durante esta tese seleccionámos nanopartículas de ouro porque é relativamente fácil a imobilização de altas concentrações de LL37 por unidade de superfície, a modificação das suas propriedades (incluindo tamanho, carga e morfologia), e pelo facto destas nanopartículas terem sido utilizadas na prática clínica há muitos anos. Estas nanopartículas possuem um tamanho controlado (21 nm), baixa polidispersão, um potencial zeta positivo (15 mV), alta densidade de LL37 (250 μg de péptido por mg de nanopartícula) e alta estabilidade em soluções aquosas e meios de cultura celular. As nanopartículas mostraram actividade antimicrobiana contra E. coli e elevada actividade biológica contra células de mamíferos, ou seja, actividade pró-angiogénica em células endoteliais e actividade pró-migratória em queratinócitos. Surpreendentemente, as nanopartículas conjugadas com LL37 possuem menor citotoxicidade que o péptido LL37 livre. Os nossos resultados mostram ainda que as nanopartículas são internalizadas pelos queratinócitos e células endoteliais, e no caso de queratinócitos, o processo de internalização é mediado principalmente pelo receptor scavenger. As nanopartículas internalizadas tendem a se acumular no compartimento endolisomal dos queratinócitos, mas conseguem escapar o compartimento endolisomal em células endoteliais. Em ambos os modelos celulares, as nanopartículas induzem a transactivação do EGFR. No caso dos queratinócitos, o processo é iniciado pela activação de receptores P2X que levam a uma prolongada fosforilação de EGFR e de ERK. Isto leva a que os queratinócitos possuam maiores propriedades migratórias. Os resultados in vivo mostram que nanopartículas conjugadas com LL37 têm melhores propriedades cicatrizantes de feridas comparativamente ao péptido livre. No caso de células endoteliais, o péptido LL37, mas não as nanopartículas conjugadas com LL37, levam à activação do receptor FPRL-1, à acumulação de cálcio intracelular e à secreção de VEGF165. No entanto, tanto o péptido LL37 como as nanopartículas conjugadas com LL37 têm elevada actividade pró-angiogénica, demonstrado num ensaio de membrana corioalantóica (CAM). É provável que a actividade pró-angiogénica das nanopartículas conjugadas com LL37 seja mediada pela transactivação de EGFR, mas mais estudos são necessários para responder a esta questão. Os resultados apresentados nesta tese são um primeiro passo para o desenvolvimento de terapias baseadas em nanomedicina à base de péptidos antimicrobianos. Esta é a primeira terapia que combina propriedades de cicatrização de feridas e actividade antimicrobiana na mesma formulação, é mais barata do que as terapias avançadas actuais, e pode ser administrada uma única vez.

Impaired wound healing and its medical complications remain one of the most prevalent and economically burdensome healthcare issues in the world. In the United States alone, chronic wounds affect 6.5 million patients. More than US$25 billion is spent annually on treatment of chronic wounds and the burden is growing rapidly due to increasing health care costs, an aging population and a sharp rise in the incidence of diabetes and obesity worldwide. Recent data indicate that 11.7% of the Portuguese population is diabetic. One of the most serious and debilitating complications of diabetes is the development of chronic non-healing wounds. In recent years, there have been efforts to develop new advanced methodologies to heal chronic wounds including the use of topic growth factors or cell-based thera- pies. Unfortunately, in many cases, the therapeutic efficacy is low, the therapies are expensive and require application in a clinical facility, and they have no antimicro- bial activity. Therefore, development of new therapeutics is absolutely necessary and important to satisfy the unmet clinical need. Antimicrobial peptides (AMPs) synthesized in the skin provide a barrier to infection and some of them are very im- portant for the regeneration of skin. LL37 is the most important AMP in skin, acts as first line of defense against bacteria, virus, fungi and plays an important role in im- munomodulation, angiogenesis and wound healing properties. Recently, phase I/II clinical trials have demonstrated its therapeutic efficacy in chronic wounds; how- ever, multiple topical administrations were required. The main goal of this the- sis was to develop a LL37 nanoparticulate formulation with higher wound healing properties than the free peptide. The nanoparticulate formulation was prepared by a novel methodology in which thiol-terminated LL37 acts as capping agent during NP formation. This formulation has a gold (Au) core and a hydrophilic cationic LL37 peptide shell. We have selected Au NPs because it is relatively easy the immo- bilization of high concentrations of LL37 per surface area, the modification of their properties (including size, charge and morphology), and they have been used in the clinic for many years. LL37-Au NPs have controlled size (21 nm), low polydisper- sity, positive zeta potential (15 mV), high density of LL37 (250 μ g of peptide per mg of NP) and high stability in aqueous solutions and cell culture media. They showed antimicrobial activity against E . coli and high biological activity against mammalian cells, namely pro-angiogenic activity against endothelial cells and pro-migratory activity against keratinocytes. Remarkably, LL37-Au NPs have lower cytotoxicity than LL37 peptide. Our results further show that LL37-Au NPs are internalized by keratinocytes and endothelial cells, and in case of keratinocytes, the internalization process is mostly mediated by scavenger receptors. The internalized LL37-Au NPs tend to accumulate in the endolysomal compartment in keratinocytes while escape the endolysomal compartment in endothelial cells. In both cell models, LL37-Au NPs induce the transactivation of EGFR. In case of keratinocytes, the process is ini- tiated by the activation of P2X receptors that leads to a long-lasting phosphorylation of EGFR and ERK. This results in enhanced migratory properties of keratinocytes. In vivo results show that LL37-Au NPs have superior wound healing properties than LL37 peptide in a splinted mouse full thickness excisional model. In case of endothelial cells, LL37 peptide but not LL37-Au NPs activate FPRL-1, intracellular accumulation of Ca 2 + and secretion of VEGF165. Yet, both LL37 and LL37-Au NPs have high pro-angiogenic activity as demonstrated in a chorioallantoic membrane (CAM) assay. It is likely that the pro-angiogenic activity of LL37-Au NPs is medi- ated by the transactivation of EGFR but further studies are needed to address this issue. The results presented here are an exciting first step toward the development of antimicrobial peptide-based nanotherapeutics for skin disorders paving the way for additional studies in more complex animal models. It is the first skin therapy that combines wound-healing efficacy and antimicrobial activity in the same for- mulation, it is cheaper than the actual advanced therapies, and may be administered only one time.