Human sperm mobility: proteins and metabolites towards the same journey's end

Abstract

Mammalian sperm motility is a prerequisite for in vivo fertilization and alterations in this parameter are commonly observed in infertile males. However, we still do not have a complete understanding of the molecular mechanisms controlling it. The first aim of this study was to identify proteins involved in human sperm motility deficiency, by using TMT protein labeling and LC-MS/MS to compare proteins of sperm samples differing in motility (asthenozoospermic versus normozoospermic). LC-MS/MS resulted in the identification of 1157 proteins, of which 80 proteins were found differentially abundant between the two groups of samples. The differential proteins were analyzed by GO, cellular pathways and clustering analyses and resulted in the identification of core deregulated proteins and pathways associated with sperm motility dysfunction. These included proteins associated with energetic metabolism, protein folding/degradation, vesicle trafficking and the cytoskeleton. Contrary to what is usually accepted, these outcomes support the hypothesis that several metabolic pathways (notably mitochondrial-related ones) contribute towards regulating sperm motility. Moreover, this work considerably contributes to the increase of the compiled list (185 proteins) of differentially expressed proteins in asthenozoospermic samples. Additionally, the second objective of this study was to contribute to the first comprehensive metabolomic characterization of human sperm cell extracts through the application of two untargeted metabolomics platforms based on proton nuclear magnetic resonance (1H-NMR) spectroscopy and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). Using these two complementary strategies we were able to identify a total of 69 metabolites, of which 42 were identified using NMR, 27 using GC-MS and 4 by both techniques. The identity of some of these metabolites was further confirmed by two-dimensional 1H-1H homonuclear correlation spectroscopy (COSY) and 1H-13C heteronuclear single-quantum correlation (HSQC) spectroscopy. Most of the metabolites identified are reported here for the first time as present in mature human sperm. The relationship between the metabolites identified and the previously reported sperm proteome was also explored. Interestingly, overrepresented pathways included not only the metabolism of carbohydrates, but also of lipids and lipoproteins. Of note, a large number of the metabolites identified belonged to the “amino acids, peptides and analogues” super class. The identification of this initial set of metabolites represents an important first step to further study their function in male gamete physiology and to explore potential reasons for dysfunction in future studies. We also demonstrate that the application of NMR and MS provides complementary results, VI thus constituting a promising strategy towards the completion of the human sperm cell metabolome. Furthermore, we have performed the first combined analysis of the human sperm identified metabolites and human sperm compiled proteome, using bioinformatic tools. This resulted in interesting outcomes, with metabolism as a most significant pathway, but also reinforcing the importance of fatty acids oxidation and lipids metabolism, among others. Alltogether, our study show the importance of performing an integrated analysis (proteomics and metabolomics) to biologicaly better understand human sperm cells. We have also preformed the preliminary comparison between the metabolic fingerprints of extracts of human sperm samples with different motility. As very preliminary outcomes, we observed a general lower concentration of the identified metabolites in asthenozoospermic samples when compared to normozoospermic ones. In conclusion, our work aimed to contribute to better understand human sperm motility (at protein and metabolite level) and also to iniciate the analysis of human sperm metabolome. These will hopefully contribute to increase our knowledge about the molecular basis of male gametes and also to better understand human sperm (dys)function and male (in)fertility.

A mobilidade dos espermatozoides é um pré-requisito para a fertilização in vivo em mamíferos e alterações neste parâmetro são frequentemente observadas em machos inférteis. Em humanos esta patologia (percentagem de espermatozoides móveis reduzida) é definida como asthenozoospermia. Contudo, os mecanismos moleculares que controlam a mobilidade dos espermatozoides não estão completamente descodificados. Assim, o primeiro objectivo deste trabalho foi identificar proteínas envolvidas na mobilidade de espermatozoides humanos através de proteómica diferencial utilizando amostras normozoospérmicas e astenozospérmicas. As proteínas das diferentes amostras foram marcadas com marcadores isobáricos (TMT) e posteriormente identificadas e quantificadas por cromatografia líquida e espectrometria de massa em tandem (LC-MS/MS). Esta estratégia resultou na identificação de 1157 proteínas, das quais 80 estavam presentes em quantidades significativamente diferentes em espermatozoides menos móveis. As proteínas diferenciais foram analisadas relativamente à sua ontologia génica (GO), função biológica e participação em vias celulares. Esta análise resultou na identificação de uma série de proteínas e vias desreguladas, associadas à disfunção da mobilidade espermática. Entre elas incluem-se proteínas associadas ao metabolismo energético, à conformação e degradação de proteínas, transporte de vesículas e citoesqueleto. Ao contrário do que é normalmente aceite, estes resultados vêem suportar a hipótese de que várias vias metabólicas (entre elas as mitocondriais) contribuem para a regulação da mobilidade dos espermatozoides. Este trabalho também contribuiu consideravelmente para o enriquecimento da lista de proteínas (somando um total de 185) que estão descritas como diferencialmente expressas em amostras astenozospérmicas. O segundo objectivo do presente estudo foi contribuir para a primeira caracterização metabólica de extractos de espermatozoides humanos através da utilização de duas técnicas frequentemente utilizadas para identificação não direcionada de metabolitos: espectroscopia de ressonância magnética nuclear de protão (1H-RMN) e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS). Usando estas duas estratégias complementares identificámos um total de 69 metabolitos endógenos, dos quais 42 por RMN, 27 por GC-MS e 4 identificados por ambas técnicas. A identificação de alguns destes metabolitos foi ainda confirmada através de espectroscopia de duas dimensões: correlação homonuclear 1H-1H (COSY) e correlação heteronuclear 1H-13C (HSQC). Curiosamente, grande parte dos metabolitos descritos pertence à superclasse de “aminoácidos, péptidos e análogos”. Uma vez mais, através de análise VIII bioinformática das vias biológicas em que os metabolitos descritos estão envolvidos, volta a destacar-se o metabolismos de lípidos e a beta-oxidação de ácidos gordos. A identificação deste primeiro conjunto de metabolitos constitui assim um primeiro passo para futuros estudos metabolómicos, no sentido do melhor conhecimento dos gametas masculinos a nível molecular e fisiológico, e também da caracterização de diversas patologias. Neste trabalho mostrou-se também a importância do uso de técnicas complementares que poderão constituir ferramentas valiosas na descrição e compreensão do metaboloma humano. Foi ainda explorada a relação entre a lista de metabolitos descritos com as proteínas descritas na compilação do proteoma de espermatozoides humanos, usando ferramentas bioinformáticas. Esta análise revelou a importância de vias não só como metabolismo de hidratos de carbono, mas também o metabolismo de lípidos e lipoproteinas, entre outros, constituindo assim a primeira análise integrada de proteínas e metabolitos de espermatozoides humanos. Por ultimo, neste trabalho efetuámos a primeira comparação preliminar entre a quantidade de metabolitos identificados em extractos de amostras com diferentes mobilidades. Os resultados sugerem a presença em menor quantidade de quase todos os metabolitos em extractos de espermatozoides menos móveis, abrindo assim caminho a novos trabalhos futuros para caracterização metabólica da mobilidade de espermatozoides humanos. Em conclusão, o nosso trabalho teve como principal objectivo contribuir para o melhor entendimento da mobilidade de espermatozoides humanos (a nível proteico e metabólico) e simultaneamente dar o primeiro passo na análise do metaboloma de espermatozoides humanos, contribuindo desta forma para um aumento do conhecimento sobre a base molecular dos gametas masculinos e a (dis)função dos mesmos associada à (in)fertilidade.