Development of lipoplex formulations for specific genetic material delivery to pancreatic cancer cells

Abstract

O adenocarcinoma do pâncreas é a quarta causa de morte do mundo ocidental sendo, dos tumores sólidos, o mais letal. Pacientes diagnosticados com cancro do pâncreas apresentam um prognóstico extremamente pobre com uma sobrevivência média inferior a 6 meses e uma taxa de sobrevivência de 3% a 5%. A cirurgia continua a ser a única forma de tratamento. Infelizmente, apenas 10 a 20% dos pacientes apresentam tumores operáveis aquando do diagnóstico. Para casos de tumores pancreáticos localmente avançados, inoperáveis e metastáticos não existe cura sendo a quimioterapia o tratamento usado. O cancro do pâncreas devido à sua genética é considerado um dos cancros mais complexos tendo mais mutações que qualquer outro tipo de tumor. Esta patologia apresenta ainda um padrão de expressão único de microRNAs que permite distinguir com 95% de precisão tumores pancreáticos de pancreatite e de tecido saudável. Existem ainda outras moléculas que se encontram sobre-expressas neste tipo de tumores, que apresentam um elevado potencial quer terapêutico quer de diagnóstico, nomeadamente os receptores de EphA4. A terapia génica é uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento do cancro. Os vectores não virais, como os lipossomas catiónicos, apresentam-se como uma forma simples e segura de entrega de agentes terapêuticos nas células alvo. A adição de PEG e de ligandos (como peptídeos) aos lipossomas são melhoramentos que, respetivamente, permitem a sua administração intravenosa e conferem-lhes especificidade. O objectivo deste projecto consistiu em desenvolver uma nova formulação de lipoplexos, baseada em lipoplexos de EPOPC:Chol/DNA, que possuísse a capacidade de entregar, de forma específica, material genético (nomeadamente pDNA que codifique um gene terapêutico e/ou LNAs contra microRNAs sobre-expressos) às células do cancro do pâncreas, através da sua administração intravenosa. A formulação de lipoplexos HSA-EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) apresentou uma elevada actividade biológica, mesmo na presença de soro. A aplicação de uma estratégia combinada envolvendo agentes quimioterapêuticos e lipoplexos demonstrou que alguns fármacos têm a capacidade de aumentar substancialmente a actividade biológica dos lipoplexos. Além disso, esta formulação demonstrou também uma elevada eficiência de entrega de LNAs às células. Contudo, quando os lipoplexos foram preparados com LNAs pré-incubados com pDNA a eficiência dos LNAs diminuiu significativamente. Foram também desenvolvidas estratégias de pós-peguilação e de direcionamento para os receptores EphA4 usando peptídeos (APY ou KYL), por forma a obter complexos estáveis e específicos. De todas as formulações desenvolvidas apenas a formulação EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) contendo 2 mol% de CerC8-PEG apresentou elevada actividade biológica, semelhante à obtida com os lipoplexos controlo. As restantes formulações de lipoplexos, contendo DSPE-PEG-MAL, com ou sem peptídeos, apresentaram uma baixa actividade biológica, muito provavelmente porque estes lipoplexos não são capazes de sair da via endocítica. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que estratégias combinadas, envolvendo agentes de quimioterapia e terapia génica, poderão ser de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais para aplicação no cancro do pâncreas. No que diz respeito aos sistemas de transporte e entrega de material genético, os lipoplexos baseados em EPOPC:Chol/DNA, contendo pequenas quantidades de Cer-PEG, apresentam um elevado potencial para aplicação in vivo. Contudo, é necessário fazer trabalho adicional para desenvolver uma formulação que possua a capacidade de entregar, de forma específica e eficiente, o material genético às células do cancro do pâncreas.

Pancreatic adenocarcinoma is the most lethal solid tumor, being the fourth cause of death in the western world. Pancreatic cancer patients have an extremely poor prognosis with a median survival inferior to 6 months and a survival rate of 3-5%. Surgery remains the only treatment offering an advantage in terms of overall survival but, unfortunately, only 10-20% of the patients present resectable disease at the time of diagnosis. For locally advanced, unresectable, and metastatic disease, treatment is palliative being chemotherapy the standard approach. The genetics of pancreatic cancer makes it one of the most complex malignant diseases, with more mutations than any other common tumor type. An unique miRNA signature was identified in pancreatic cancer distinguishing this cancer from normal and benign pancreas and pancreatitis with 95% of accuracy. Other molecules that are overexpressed in pancreatic tumors present a great potential as tools for diagnose and therapy, namely EphA4 receptors. The broad field of gene therapy promises a number of innovative treatments that are likely to become important in preventing death from cancer. Cationic liposomes are non-viral vectors and represent a simple and, most importantly, a safe way to deliver therapeutic molecules into the target cells. PEG molecules and ligands (such peptides) are common improvements allowing intravenous applications and conferring specificity, respectively, to the liposomes. The purpose of this work was the development of a new lipoplex formulation, based on EPOPC:Chol/DNA lipoplexes, that had the ability to specifically deliver genetic material (namely pDNA encoding a therapeutic gene and/or LNAs against miRNAs overexpressed in PDAC) to pancreatic cancer cells, by using an intravenous administration pathway. The HSA-EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) lipoplex formulation showed a high biological activity, even in the presence of serum. The application of a combined strategy involving chemotherapeutic agents and lipoplexes demonstrated that some drugs had the ability to strongly increase the transfection activity of lipoplexes. It was also observed that the HSA-EPOPC:Chol/LNA 4/1 (+/-) formulation is an efficient carrier to deliver LNAs, although this efficiency had been significantly reduced when LNAs were pre-incubated with pDNA. It was also developed a post-pegylation strategy and a targeting approach to the EphA4 receptors using peptides (APY or KYL). From all the developed formulations only the EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) lipoplexes with 2mol% of CerC8-PEG presented high biological activity, similar to that obtained with the positive control lipoplexes. The lipoplex formulations containing DSPE-PEG-MAL molecules, with or without peptide, had low transgene expression, most probably due to their entrapment in the endolysomal pathway. Overall, the obtained results indicate that combined strategies involving chemotherapeutic agents and gene therapy approaches could be of great importance for the development of new antitumor strategies for application in pancreatic cancer. Regarding the gene delivery systems, the EPOPC:Chol/DNA-based lipoplexes incorporating low amounts of Cer-PEG presented high potential for in vivo applications. However, more work should be done in order to develop a formulation that had the ability to specifically and efficiently deliver genetic material into pancreatic cancer cells.