Human sperm mitochondrial function : implications for male (in)fertility

Abstract

As mitocôndrias são organelos dinâmicos que geram ATP por fosforilação oxidativa. Este processo depende da existência de um gradiente electroquímico ao longo da membrana mitocondrial interna, gerado pelo bom funcionamento da cadeia respiratória mitocondrial, e cujos complexos proteicos são codificados por dois genomas: o genoma nuclear e o genoma mitocondrial. Os espermatozóides humanos contêm um número variável de mitocôndrias na peça intermédia, que são responsáveis pelo fornecimento de energia para as mais diversas funções celulares, incluindo a mobilidade dos gâmetas masculinos. Com o objectivo de clarificar o papel da mitocôndria e do seu genoma (ADNmt) no funcionamento dos espermatozóides e na (in)fertilidade masculina, procedeu-se à análise de uma série de aspectos celulares e moleculares relacionados com a mitocôndria. Para isso, usaram-se amostras de esperma de qualidade distinta, fornecidas por pacientes que recorreram a um laboratório de reprodução assistida. Mostrou-se, através da técnica de PCR em tempo real, que os espermatozóides humanos possuem um número variável de moléculas de ADNmt, e que o conteúdo em ADNmt é baixo, quando comparado com células somáticas. Além disso, este conteúdo parece ser inversamente proporcional à qualidade espermática. Numa tentativa de entender a razão pela qual amostras de diferente qualidade apresentam conteúdos dissimilares de ADNmt, procedeu-se ao estudo de duas proteínas relacionadas com a sua manutenção: a ADN polimerase gama (POLG, a única ADN polimerase existente na mitocôndria) e o factor de transcrição mitocondrial A (TFAM; que está envolvido nos processos de transcrição e replicação do ADNmt). Antes de mais, usando as técnicas de imunocitoquímica e “western-blotting”, mostrou-se que espermatozóides humanos expressam estas duas proteínas na peça intermédia. Para além disso, a expressão destes dois factores parece estar correlacionada com os principais parâmetros de avaliação da qualidade seminal (concentração, mobilidade e morfologia dos espermatozóides). Resultados semelhantes foram obtidos para a expressão de duas proteínas da cadeia respiratória: subunidades I e VIc da citocromo c oxidase (COXI e COXVIc, respectivamente). Paradoxalmente, a presença de POLG parece predizer, de forma inversa, o conteúdo em ADNmt. Este factor poderá, então, ter um papel na regulação do número de cópias de ADNmt em espermatozóides, embora os mecanismos desta possível regulação não tenham sido determinados. A relevância da POLG na função espermática foi também estudada a nível genético, tendo este estudo incidido particularmente numa região do gene que contém repetições de nucleótidos CAG de tamanho variável. Para isso, usaram-se as técnicas de PCR de fluorescência e sequenciação de ADN. Os resultados mostraram que, embora as amostras de pior qualidade apresentem uma maior incidência de heterozigotia, este polimorfismo não parece afectar os principais parâmetros seminíferos, nem o conteúdo em ADNmt, ou a expressão de POLG. Assim, e apesar do significado biológico destes variantes genéticos não ter sido clarificado, a sua análise não parece ter relevância clínica. Por outro lado, a análise de subpopulações de espermatozóides com capacidade de movimentação distinta (isoladas usando o método clássico de “swim-up”) confirmou a correlação entre a expressão das proteínas POLG e COXI e a mobilidade espermática. Além disso, o estudo de fracções de espermatozóides com diferente potencial de membrana mitocondrial (usando a sonda “MitoTracker Green” e um aparelho de “sorting” celular) sugeriu que a expressão destas proteínas contribui para a manutenção da função mitocondrial. A capacidade da sonda “MitoTracker Green” (bem como das sondas “MitoTracker Red” e “JC-1”) monitorizar o potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides foi determinada usando microscopia de fluorescência, através da incubação de espermatozóides com disruptores do potencial, tanto antes como após a incubação com as sondas. Qualquer xiii uma das três sondas parece monitorizar o potencial de membrana de espermatozóides no momento da incubação. No entanto, nenhuma delas é suficientemente dinâmica para revelar alterações no potencial que ocorram após a incubação dos espermatozóides com as sondas. Por último, procedeu-se a um estudo preliminar usando diferentes marcadores celulares, com o intuito de determinar o possível valor clínico da análise dos seguintes parâmetros funcionais: potencial de membrana mitocondrial, integridade membranar, estado do acrossoma e estado da cromatina. Neste estudo foram usadas, não apenas amostras de pacientes que recorreram a um laboratório de reprodução assistida, mas também amostras de dadores saudáveis. Os resultados sugerem que todos os parâmetros avaliados são significantes, em especial a análise do potencial de membrana mitocondrial e da integridade membranar.

Mitochondria are dynamic organelles that generate ATP through oxidative phosphorylation, which takes place within the electron transfer chain (ETC) and depends on the existence of an electrochemical potential across the inner mitochondrial membrane. The ETC is the only cellular apparatus that is encoded by both the nuclear and the mitochondrial (mtDNA) genomes. Human sperm contain a variable number of mitochondria in the midpiece, where these organelles might supply sperm with energy for several proposes, including sperm motility. In order to better understand the role of mitochondria and its genome in human sperm function and male (in)fertility, a number of mitochondrial-related features was analysed in the present study, using distinct quality sperm samples from men attending an infertility clinic. Using real-time PCR, it was shown that human sperm possess a variable number of mtDNA molecules, which is invariable low when compared to somatic cells, and seems to be inversely proportional to sperm quality. In an attempt to understand why distinct quality sperm samples present dissimilar mtDNA content, two proteins related with its maintenance were studied: DNA polymerase gamma (POLG; the sole DNA polymerase in mitochondria) and mitochondrial transcription factor A (TFAM; which is involved in both the transcription and replication of mtDNA). Using both immunocytochemistry and western blotting, it was shown that human sperm express these proteins in the midpiece. Moreover, the expression of these factors seems to be correlated with sperm concentration, motility and morphology (the three main sperm quality parameters). Similar outcomes were obtained for two proteins of the ETC: cytochrome c oxidase subunits I and VIc (COXI and COXVIc, respectively). Paradoxically, the presence of POLG seems to negatively predict mtDNA copy number. xvi POLG may, therefore, play a role in regulating sperm mtDNA copy number, although the exact mechanism of this possible regulation remains undetermined. The relevance of POLG in sperm function was additional studied at the gene level, particularly on a variable-length CAG-repeat region, using both fluorescent PCR and DNA sequencing. Although poorer quality sperm samples presented a higher incidence of heterozygosity for the POLG CAG-repeat genotype, these polymorphisms did not seem to affect the three sperm principal parameters, nor mtDNA copy number or POLG expression. Thus, and while the biological meaning of these variants remains unclear, their clinical significant seems irrelevant. The analysis of subpopulations of sperm presenting distinct ability to swim (isolated using the classical swim-up procedure) confirmed the correlation between the expression of both POLG and COXI and sperm motility. Moreover, the study of sperm fractions with distinct mitochondrial membrane potential (MMP; using MitoTracker Green and a cell-sorter) suggested that the expression of these proteins contributes for the maintenance of mitochondrial function. The ability of MitoTracker Green (as well as MitoTracker Red and JC-1) to monitor sperm MMP was determined, using fluorescence microscopy, by incubating sperm with distinct MMP disrupters, either before or after the incubation with the probes. The three mitochondrial probes provided similar results, and seemed to monitor sperm MMP at the time of incubation. However, none of them was dynamic enough to reveal MMP alterations occurring after the incubation with the probes. Finally, a preliminary approach was conducted using distinct cellular markers, to determine the clinical value of the assessment of different sperm functional parameters: MMP, membrane integrity, acrosomal status and chromatin status. Importantly, these parameters were analysed not only in sperm samples from patients, but also from healthy donors. All the traits analysed seem to be significant, with emphasis on both MMP and membrane integrity.