Profiling the control of hepatic glucose and lipid metabolism for evaluating novel strategies of insulin delivery

Abstract

Diabetes mellitus (DM) is a metabolic disorder that results from a dysfunction of insulin secretion (type 1) and/or sensitivity (type 2). Type 1 and in many cases type 2 diabetic patients require daily insulin injections to control blood glucose levels and retard the appearance of diabetes-related complications. The liver plays a central role in the context of whole-body glucose homoeostasis and fuel management in general. Under physiological conditions, insulin is released by the pancreas into the portal vein and reaches the liver along with the nutrient flow absorbed in the gastrointestinal tract (GIT). Under these conditions, the actions of insulin on liver metabolism play a key role in promoting glucose and lipid storage. DM is characterized by impairment of these actions resulting in abnormal levels of blood glucose and lipids that, if left untreated, provoke widespread secondary complications. With current therapies, insulin is delivered subcutaneously and this results in a predominantly peripheral uptake, in contrast with the physiological release profile. The experimental work described on this thesis addressed the pathways for glucose disposal and storage in the liver under two experimental settings representing the fasted to fed transition and the fed state. The studies were performed in nondiabetic control rats and in a rat model for type 1 DM, the streptozotocin (STZ)-diabetic rat. The delivery of insulin by alternative liver-targeted routes was also explored. A general introduction is presented in chapter 1. Diabetes and its therapy are briefly addressed and the STZ-diabetic rat model for the study of type 1 DM is introduced. Hepatic glucose and lipid metabolism are overviewed with emphasis to its regulatory aspects, and molecular mechanisms of insulin signaling are integrated with the metabolic regulation. In the last section of this chapter the use of stable isotope tracers for the study of hepatic metabolism is briefly overviewed. In the studies described in chapter 2, rats were challenged with a carbohydrate load after a 24-hour fast and glucose disposal was addressed by carbon 13 (13C) and deuterium (2H) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. One group of animals was given a glucose load and the other a mixture consisting of 9 equivalents of glucose and 1 equivalent of galactose. Hepatic glycogen was depleted with fasting and increased 8-10 times after the carbohydrate loads. The gluconeogenic flux dominated both glycogen synthesis and endogenous glucose production (EGP). Galactose hepatic metabolization resulted in a decreased contribution of load glucose to glycogen but apparently had little effect on the clearance of load glucose from the blood. Chapter 3 presents the glucose challenge study performed in STZdiabetic rats after a 24-hour fast. One group of animals was injected insulin by the subcutaneous (s.c.) route prior to receiving the glucose load. In another group insulin was delivered to the intraperitoneal (i.p.) cavity to provide a higher portal/peripheral ratio and target the liver. In a last group, rats did not receive any treatment. Glucose disposal was traced by 13C and 2H NMR methods. There was no net hepatic glycogen synthesis during the test, not even in the insulin-treated rats. The untreated STZ-diabetic rats showed increased EGP coupled with reduced clearance of load glucose. The absolute contribution of EGP to blood glucose in the insulin-treated rats was reduced to control levels, regardless of the route of insulin administration. Glucose clearance was highly enhanced in the insulin-treated rats even when compared to controls. These studies indicate that in the context of a glucose challenge, the stimulatory effect of insulin on glucose uptake is much higher than its inhibitory effect on EGP. The absorptive state was addressed in chapter 4, and hepatic metabolism was studied in ad libitum fed STZ-diabetic and non-diabetic control rats with the deuterated water (2H2O) tracer approach. In controls, net glycogen synthesis during an overnight feeding accounted for one third of the hepatic stores and was equally derived from the direct and indirect (gluconeogenic) pathways. The amount of glycogen synthesized by diabetic rats was similar to controls in all stages of the disease but the hepatic glycogen content was lower 10 and 20 days after the induction by STZ, indicating that those animals had higher glycogen turnover rates. There was a progressive increase of the indirect pathway contribution to hepatic glycogen synthesis from 70% 4 days after diabetes induction to 90% at 10 and 20 days of the disease. Parallel to the disruption in glycogen synthesis, the contribution of gluconeogenesis to EGP was profoundly increased 10 and 20 days after diabetes induction but not in the earlier stage (4 days). The lipogenic pathway was promptly reduced 4 days after the induction of diabetes but the hepatic triglyceride (TG) content was similar to controls. With the progression of the diabetic condition, the contribution of the lipolytic flux increased, resulting in elevated hepatic TG content. Chapter 5 describes the insulin replacement experiments in STZdiabetic rats. The treatment protocol consisted in two daily injections by the s.c. or i.p. route and was carried out for 10 days. Hepatic metabolism was then addressed by the 2H2O method under natural feeding conditions. Gene expression and enzyme activity assays were also performed in liver samples from those rats. With both treatments there was a restoration of the direct pathway to glycogen synthesis and of the pathways to EGP. In the i.p.- treated rats glycogen stores could be recovered to control levels. The lipogenic pathway was also enhanced but was still lower than controls in both s.c.- and i.p.-treated groups. Despite the improvements on glycogen and TG synthesis in the liver, the gluconeogenic and lipolytic fluxes could not be efficiently suppressed with the insulin-replacement protocols. Chapter 6 explores the use of novel nanoparticle-based delivery systems in insulin therapy. Experiments in control rats showed that the hypoglycemic response following s.c. injection of insulin was enhanced by the use of nanoparticles from poly-lactide-co-glycolide (PLGA), especially when γ-cyclodextrin esters with 10 carbon alkyl chains (γ-CDC10) were present in the formulation. The oral route was also investigated but the nanoparticles were ineffective even after coating with an enteric polymer. Experiments in STZ-diabetic rats did not demonstrate any benefit of the nanoparticle formulation relative to a standard insulin solution in terms of the hypoglycemic response following the s.c. injection nor in the context of a glucose challenge.

A diabetes mellitus constitui um perturbação metabólica que resulta de uma disfunção na secreção (tipo 1) e/ou sensibilidade (tipo 2) à insulin. Os doentes do tipo 1, e em muitos casos também do tipo 2, necessitam de injecções diárias de insulina para controlar os níveis plasmáticos de glucose e retardar o aparecimento de complicações relacionadas com a doença. O fígado é um órgão central na regulação da homeostase da glucose e na gestão energética em geral. Em condições fisiológicas, a insulina é secretada pelo pâncreas para a veia porta e chega ao fígado de forma consertada com a absorção de nutrientes no tracto gastrointestinal. Nestas condições, os efeitos da insulina no metabolismo hepático são fundamentais para promover o armazenamento de glucose e lípidos. A diabetes é caracterizada por perturbações nestes efeitos, que se refletem em níveis anormais de glucose e lípidos no sangue, os quais, não corrigidos, provocam o alastramento de complicações secundárias. Na terapêutica tradicional, a insulina é administrada por via subcutânea (s.c.), o que resulta numa insulinização predominantemente periférica, por oposição ao perfil de libertação fisiológico. O trabalho experimental descrito nesta tese estudou a captação e consumo de glucose pelo organismo e seu armazenamento no fígado em dois contextos experimentais representando a transição do jejum para o estado prandial e o estado prandial propriamente dito. Os ensaios foram realizados em ratos controlo e ratos tornados diabéticos por indução com estreptozotocina (STZ), um modelo animal para a diabetes tipo 1. Foram ainda estudadas vias alternativas para administração de insulina direccionada ao fígado. O capítulo 1 apresenta uma indrodução geral. A diabetes e o seu tratamento são abordados de forma breve e o modelo animal de diabetes induzida por STZ é apresentado. O metabolismo hepático da glucose e dos lípidos é analizado sendo dado ênfase ao seu controlo e regulação. Aspectos moleculares da transdução do sinal da insulina, com relevância para a regulação metabólica, são abordados. Por último, a aplicação de substratos enriquecidos com isótopos estáveis ao estudo do metabolismo hepático é apresentada. Nos ensaios descritos no capítulo 2, os ratos receberam uma dose massiva de açúcares após 24 horas de jejum e o consumo de glucose foi seguido por espectroscopia de ressonância magnética nuclear de carbono 13 (13C) e deutério (2H). A um grupo de animais foi administrada uma dose de glucose e a outro uma mistura que consistiu em 9 equivalentes de glucose e 1 equivalente de galactose. As reservas de glicogénio no fígado foram consumidas no período de jejum e aumentaram 8-10 vezes após a ingestão das doses de açúcares. Tanto a produção endógena de glucose como a síntese de glicogénio hepático foram dominadas pelo fluxo da neoglucogénese. A metabolização hepática da galactose reduziu a contribuição da glucose exógena para a síntese de glicogénio mas pouco alterou a captação de glucose do sangue. O capítulo 3 descreve a prova de tolerância à glucose realizada em ratos diabéticos por indução com STZ, após 24 horas de jejum. Um grupo de animais recebeu insulina por via s.c. antes da dose de glucose. Num outro grupo, a insulina foi injectada na cavidade intraperitoneal (i.p.) para aumentar a razão portal/periférica e direccionar a insulina para o fígado. Um último grupo não recebeu qualquer tratamento. O consumo de glucose foi avaliado por técnicas de RMN de 13C e 2H. Não houve síntese líquida de glicogénio no fígado, nem mesmo nos ratos injectados com insulina. Os ratos diabéticos que não foram injectados com insulina apresentaram um aumento da produção endógena de glucose acompanhado por uma redução da captação de glucose plasmática. A contribuição absoluta da produção endógena para a glucose plasmática nos ratos diabéticos injectados com insulina foi igual à observada nos controlos não diabéticos, independentemente da via de administração. O consumo de glucose proveniente da dose administrada foi bastante aumentado, mesmo em comparação com os controlos. Estes ensaios indicam que, no contexto de uma prova de tolerância à glucose, a acção da insulina é mais notória na estimulação da captação de glucose do sangue do que na inibição da produção endógena de glucose. O estado prandial propriamente dito foi abordado no capítulo 4. Ratos controlo e diabéticos por indução com STZ alimentados ad libitum foram estudados e o seu metabolismo hepático avaliado pelo método da água deuterada (2H2O). Nos ratos controlo, a síntese líquida de glicogénio durante uma noite de alimentação representou um terço do conteúdo hepático e seguiu as vias directa e indirecta (neoglucogénica) de forma equivalente. Os ratos diabéticos sintetizaram uma quantidade de glicogénio similar aos controlos em todos os estádios da doença avaliados, mas o conteúdo hepático total diminui 10 e 20 dias depois da indução da diabetes, significando que nestes casos houve uma maior renovação do glicogénio hepático. Verificou-se um domínio progressivo da via indirecta para a síntese de glicogénio, que aumentou de 70% 4 dias após a indução da diabetes para 90% 10 e 20 dias depois. Paralelamente às alterações no metabolismo do glicogénio, a contribuição da neoglucogénese para a produção endógena de glucose foi profundamente aumentada 10 e 20 dias após a indução de diabetes mas manteve-se igual à dos controlos aos 4 dias da doença. A via lipogénica foi imediatamente reduzida 4 dias depois da indução da diabetes mas o conteúdo hepático de triglicerídeos manteve-se igual ao dos controlos. Com a progressão da doença, a contribuição do fluxo lipolítico aumentou, levando ao aumento do conteúdo hepático de triglicerídeos. O capítulo 5 relata as experiências de reposição da insulina em animais diabéticos. O protocolo de tratamento consistiu em duas injecções diárias por via s.c. ou i.p. durante 10 dias. O metabolismo hepático foi, então, seguido com 2H2O em condições de alimentação ad libitum. Foram ainda feitos ensaios de expressão genética e actividades enzimáticas em amostras de fígado destes animais. Ambos os tratamentos proporcionaram a recuperação das vias de síntese hepática de glicogénio bem como das vias para a produção de glucose para valores controlo. Os animais injectados com insulina por via i.p. apresentaram níveis de glicogénio no fígado semelhantes aos controlos. A via lipogénica também foi potenciada mas manteve-se abaixo dos valores dos controlos com ambos os tratamentos. Apesar das melhorias na síntese hepática de glicogénio e triglicerídeos, os fluxos da neoglucogénese e lipólise não foram suprimidos com os protocolos de reposição de insulina. O capítulo 6 explora o uso de novas formulações de nanopartículas na terapêutica com insulina. As experiências em ratos controlo mostraram que a acção hipoglicémica da insulina foi potenciada através do uso de nanopartículas de um co-polímero de ácido láctico e glicólico (PLGA), mormente com a inclusão de esters da γ-ciclodextrina com cadeias alquílicas de 10 carbonos (γ-CDC10). A via oral também foi investigada mas a formulação não se mostrou eficaz, nem quando as nanopartículas foram revestidas com um polímero entérico. Nas experiências em ratos diabéticos por indução com STZ não ficou demonstrado qualquer benefício da formulação de nanopartículas em relação a uma solução padrão de insulina em termos de acção hipoglicémica após administração s.c. nem no contexto de uma prova de tolerância à glucose.