Análise molecular e celular da expressão da maspina em lesões pré-neoplásicas do colo uterino

Abstract

Maspin is a serine protease inhibitor with tumor suppression activity in vitro and in vivo. It has been reported that maspin is expressed in normal human mammary epithelial cells but is dowregulated during cancer progression and that p53 could induce maspin expression by transcriptional activation. Experimental evidence consistently showed that maspin suppresses tumor growth, invasion and metastasis, induces tumor redifferention, and enhances tumor cell sensitivity to apoptosis. Maspin protein isolated from biological sources is a monomer, which is present as a secreted, a cytoplasmic, a nuclear, as well as a cell surface-associated protein. Nuclear maspin is associated with better prognosis of some cancers. It is further noted that extracellular maspin is sufficient to block tumor induced extracellular matrix degradation, tumor cell motility and invasion, whereas intracellular maspin is responsible for the increased cellular sensitivity to apoptosis. Despite these developments, the mechanistic studies of maspin have proven challenging primarily due to the lack of a prototype molecular model. The dissection and mapping of cervical carcinogenesis consequent to HPV-induced molecular alterations have yielded a series of biomarkers that potentially could be used as surrogates for identification of HPV-related disease in epithelial cells. The biomarkers could predict the biological behaviour of disease and the need for clinical intervention or continued surveillance after a preventive or therapeutic measure. Understanding the interdependent roles that host and viral factors play in cervical cancer pathogenesis is important for distinguishing women at highest risk of human papillomavirus persistence and progression to cervical cancer. The aim of our study was to evaluate maspin expression in LSIL and HSIL and to determine the relationship between the extent of maspin expression and others biomarkers like HPV in cervical intraepithelial lesions. In total, 33 cases were evaluated, 19 cases of LSIL / CIN I and 14 HSIL. A monoclonal antibody was used on paraffin/embedded tissues and the immunoreactivity was scored semi-quantitatively using a scale of 0 to 3. The identification of HVP genotypes was made by human papillomavirus PCR amplification using a detection kit optimized to amplify several genital HPV genotypes, including HPV high risk, low risk and previously not classified. The results were analyzed by paired sample Student t-test, nonparametric Chi-Square test, Mann-Whitney test and Kruskal-Wallis test. In all statistical tests, significance was considered to be achieved when p < 0,05. A diminished level of maspin expression was observed between HSIL vs LSIL. The maspin expression was also diminished in the cervical intraepithelial lesions associated with high risk HPV. All these differences are not statistically significant. However, there appears to be a trend that might achieve statistical significance if larger number cases are examined. The maspin expression was present in the totality of the cervical epithelium but the basal cells are not evolved in half of the cases of high-grade intraepithelial lesions and this was more frequently associated with high risk HPV. When low-grade lesions expresses maspin immunoreactivity in basal layer of the epithelium, light risk HPV are present or HPV genome are not present. The results suggests that others factors may contribute for these different behaviour of cervical intraepithelial lesions. The genetic susceptibility between patients was investigated by PCR amplification of regulatory and coding areas of maspin gene followed by Sanger sequencing. No significant statistical differences were found in maspin genotyping between healthy control women and those with cervical intraepithelial lesions.

A maspina é uma inibidora da protease serina com actividade de supressão tumoral in vitro e in vivo. É expressa nas células epiteliais normais da mama mas está diminuída na progressão tumoral e a p53 induz a expressão da maspina através da activação dos processos da transcrição. Estudos experimentais têm evidenciado, de forma consistente, que a maspina inibe o crescimento, invasão e metastização tumorais, induz a rediferenciação tumoral e aumenta a sensibilidade das células tumorais à apoptose. Esta proteína é um monómero que nos tecidos biológicos se encontra como produto de secreção, surge ao nível do citoplasma, do núcleo ou como uma proteína da superfície celular. A maspina nuclear está associada a melhor prognóstico de alguns cancros. A maspina extracelular é suficiente para bloquear a degradação da matriz extracelular induzida pelos tumores, a motilidade e invasão tumorais. A maspina intracelular é responsável pelo aumento da sensibilidade celular aos fenómenos da apoptose. Apesar dos progressos na investigação, os estudos sobre a maspina constituem, ainda, um desafio porque não existe um modelo protótipo da sua acção molecular. O estudo da carcinogénese no cancro do colo uterino tem oferecido uma série de biomarcadores com potencialidades para identificar as alterações moleculares induzidas pelo HPV nas células cervicais. Estes biomarcadores podem ter um valor preditivo sobre o comportamento biológico da doença, a necessidade de intervenção clínica ou de vigilância após medidas preventivas ou terapêuticas. A compreensão do papel dos factores relacionados com o hospedeiro e com o HPV na patogénese do cancro do colo do útero, é importante para identificar as mulheres em que é maior o risco de persistência da infecção por HPV ou de progressão para o cancro cervical. Com este estudo pretende-se avaliar a expressão da maspina nas LSIL e nas HSIL e determinar as relações entre a grandeza da expressão da maspina com outro biomarcador, o HPV, nas lesões intra-epiteliais cervicais. Foram avaliadas 33 biópsias cervicais 19 com diagnóstico histológico de LSIL / CIN I e 14 com HSIL (CIN II / CIN III). O estudo da expressão da maspina foi realizado a partir do material biológico conservado em blocos de parafina, utilizando um anticorpo monoclonal específico e com avaliação semiquantitativa da imunomarcação numa escala de 0 a 3. A identificação do tipo de HPV foi efectuada através de amplificação génica por PCR e usando um kit de detecção optimizado para amplificar vários genótipos do HPV, incluindo os de alto e baixo risco. A análise estatística incluiu o Student t-test, o Chi-Square test, o Mann-Whitney test e o Kruskal-Wallis test. Consideraram-se diferenças significativas quando p <0,05. A expressão da maspina foi menor nas HSIL relativamente às lesões intra-epiteliais de baixo grau bem como, nas lesões associadas ao HPV de alto risco comparativamente ao HPV de baixo risco ou com HPV não identificado. As diferenças, embora, não mostrem significância estatística manifestam uma tendência que poderá ser confirmada com um aumento do número de casos estudados. A expressão da maspina ocorreu em todas as camadas do epitélio cervical mas não houve expressão da maspina na camada basal em metade das lesões intra-epiteliais de alto grau e quando as lesões estavam associadas aos tipos de HPV de alto risco. Quando as lesões cervicais de baixo grau expressavam maspina na camada basal do epitélio, apresentavam HPV de baixo risco ou não eram identificados genomas víricos. Os resultados sugerem que eventuais factores que levem à diminuição dos níveis de maspina, podem contribuir para um risco acrescido de desenvolver lesões de alto grau. Com o objectivo de avaliar se eventuais polimorfismos genéticos podiam justificar alguns dos desvios observados, procedeu-se á amplificação por PCR de zonas reguladoras e codificadoras do gene da maspina seguida de sequenciação do gene pelo método Sanger, na população com lesões cervicais e numa população controlo, saudável. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre as duas populações.